Funding for this research was provided by the US Army Medical Research and Materiel Command (Grant account no. W81XWH-11-1-0700) and the Stem Cell Research Fund. PAB and EMP were recipients of Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).

1. Préparation du support pour les plaques à 96 puits <ol><li> Créer une carte de la plaque 96 puits décrivant les différents substrats et types de cellules à examiner (Figure 1). </li><li> Procurez-vous les solutions de stockage de différents substrats [poly-L-lysine, la fibronectine, collagène de type I, la laminine, et entactine-collagène IV-laminine (ECL)], une plaque de 96 puits à puits multiples et prépare un poste de travail dans une culture cellulaire stérile capot. </li><li> Préparer substrats individuels par dilution en bouillon stérile saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration finale de 5 pg / ml (cette concentration a été précédemment déterminée sur la base d&#39;un essai dépendant de la concentration du substrat pour la croissance et la prolifération de cellules). Mélanger à l&#39;aide d&#39;un vortex avant de verser dans un réservoir stérile. </li><li> Ajouter 100 pi de solution de substrat dans chaque puits selon la carte 96 puits (Figure 1) (une micropipette de 12 ou 8 canaux est pratique pour micropipetage dans une plaque de 96 puits). Sceller le couvercle de la plaque à 96 puits en utilisant une bande de Parafilm et stocker une nuit à 4 ° C. </li></ol> 2. cellulaire Placage et imagerie time-lapse REMARQUE: Souris MSC ont été isolés à partir de la moelle osseuse des adultes souris C57BL / 6 et maintenu en tant que ligne de cellules adhérentes. MSC ont été infectées en utilisant des vecteurs lentiviraux de les concevoir de sécréter brain-derived neurotrophic factor (BDNF; ADNc humain) et gliale facteur neurotrophique dérivé des cellules gliales (GDNF; ADNc humain) en utilisant codant pour le BDNF (LV-BDNF de vecteur lentiviral; CMV-BDNF-IRES GFP), GDNF (LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP), et la protéine fluorescente verte (GFP, GFP-LV; CMV-GFP). REMARQUE: Milieux de culture de cellules souches mésenchymateuses de souris (MSC) est milieu de Dulbecco modifié par Iscove contenant 10% de sérum d&#39;hybridome qualifié de veau fœtal, 10% de sérum équin, 2 mM de L-glutamine et 10 000 U / ml de pénicilline, 10 mg / ml de streptomycine . Les cinq types de cellules souches mésenchymateuses (CSM de souris, GFP-MSC, BDNF-GFP-MSC, GDNF-GFP-M différentsSC et BDNF / GDNF-GFP-CSM) ont été étalées à environ 30% de confluence dans des fioles T75 pour culture cellulaire. <ol><li> Cellule Placage <ol><li> Le lendemain, retirez les solutions de substrat par aspiration et rincer chaque puits avec environ 200 pi de PBS stérile, deux fois. Ajouter milieux de culture cellulaire (200 pl / puits) à chaque puits après le rinçage final PBS. Placer la plaque à 96 puits dans un incubateur de culture cellulaire réglé à 37 ° C et 5% de CO 2 pour atteindre l&#39;équilibre. </li><li> Bien que la plaque à 96 puits est en équilibre dans l&#39;incubateur, récolter les cellules (cellules souches mésenchymateuses dans des flacons T75 devrait être d&#39;environ 70% de confluence au moment de la récolte / placage) en collectant le milieu de croissance (ci-médias conditionné) à partir du flacon T75 et stocker dans un tube conique de 15 ml dans des conditions stériles (ce milieu conditionné est utilisé dans l&#39;étape 2.1.4 ci-dessous). </li><li> Ajouter 8 ml de PBS stérile dans le flacon et agiter doucement, puis la pipette au large de la PBS et ajouter 1 ml de trypsine à 0,05% et 0,01%solution d&#39;EDTA pour détacher les cellules de la surface de culture du flacon T75. Surveiller détachement cellulaire en visualisant le flacon en utilisant un microscope inversé équipé d&#39;optiques à contraste de phase. </li><li> Lorsque les cellules ont détaché, immédiatement ajouter 8 ml de milieu conditionné (recueillies à l&#39;étape 2.1.2) dans le ballon. Recueillir la suspension de cellules et les transférer dans un tube à centrifuger conique de 15 ml et on centrifuge pendant 4 min à 450 x g pour sédimenter les cellules. </li><li> Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 200 pi de frais et chauffée (37 ° C) des milieux de culture cellulaire. </li><li> Déterminer le nombre de cellules dans la suspension cellulaire en effectuant une numération bleu trypan cellules viables en utilisant un hémocytomètre. Plaque les cellules à une densité d&#39;environ 300 cellules / puits dans les puits appropriés de la plaque de 96 puits. </li><li> Répétez ces étapes pour chaque population de cellules. </li></ol></li><li> Imagerie time-lapse <ol><li> Une fois que tous les MSC ont été plaqués, lieula plaque à 96 puits dans un incubateur pendant 2 heures pour permettre aux cellules souches mésenchymateuses pour fixer au substrat. </li><li> Démarrez le système HCS et attendre 2 heures pour le système de se équilibrer. Régler le dispositif de commande de l&#39;environnement de 37 ° C et connecter une bouteille de gaz mixte contenant 5% de CO 2 dans l&#39;air de la chambre climatique HCS système fournissant une source d&#39;air constant. </li><li> Retirer la plaque de 96 puits de l&#39;incubateur après la période d&#39;équilibrage de 2 h et placer directement dans la chambre du système HCS de la croissance cellulaire. Laisser 30 minutes pour atteindre l&#39;équilibre pour tenir compte de toute expansion liée à la chaleur de la plaque et puis démarrez le logiciel d&#39;acquisition et d&#39;analyse d&#39;image pour configurer les paramètres de la plaque. </li><li> Sélectionnez l&#39;objectif 20X pour l&#39;imagerie. Sélectionnez deux puits par condition [c.-à-GFP-MSC sur la fibronectine, etc. (6 x 5 substrats sous-type du MSC pour un total de 30 conditions x 2 = 60 répétitions puits au total)] pour la mise en place imagerie time-lapse. Choisissez deux sites pour l&#39;imagerie avecdans chaque puits. </li><li> Choisissez les longueurs d&#39;onde de lumière correctes pour l&#39;imagerie. REMARQUE: Deux longueurs d&#39;onde différentes (phase de contraste et de fluorescence de la GFP) ont été sélectionnés pour l&#39;imagerie time-lapse. </li><li> Focus sur le fond du puits avec l&#39;autofocus laser et prendre des images de test pour plusieurs sites et plusieurs puits pour trouver un plan focal optimisé. </li><li> Une fois que l&#39;accent a été mis en place, commencer à capturer des images toutes les 5 minutes pendant 48 heures pour tous les 60 puits (120 sites). </li><li> Nourrir les cellules toutes les 24 heures en retirant la plaque 96 puits du système HCS. Retirer 75 ul de milieu de chaque puits et ajouter 100 ul de milieu frais à chaque puits (équilibrer ce média frais à 37 ° C et 5% de CO 2). </li><li> À la fin de l&#39;expérience time-lapse, retirez la plaque de 96 puits du système HCS. Dans des conditions stériles, recueillir les échantillons de milieu conditionné provenant de chaque puits et transférer ces échantillons à un autre plaque de 96 puits. NOTE: Ces échantillons peuvent être utilisés pour d&#39;autres analysest en effectuant ELISA pour des facteurs neurotrophiques. </li><li> Préparer la plaque 96 puits avec CSM cultivées pour des tests supplémentaires tels que dosage de la prolifération des cellules Ki67 ou l&#39;iodure de propidium morts dosage direct / de coloration (voir détails ci-dessous). </li><li> Effectuer l&#39;analyse d&#39;imagerie time-lapse pour la cellule suivi la migration / cellulaire comme décrit dans la section 5 ci-dessous. </li></ol></li></ol> 3. Ki67 prolifération cellulaire et de l&#39;iodure de propidium Live / Assay Morte <ol><li> Ki67 prolifération cellulaire Assay (immunocytochimie) <ol><li> Rincer les cultures de cellules avec 0,1 M de phosphate (PO 4) du tampon pendant une minute à deux reprises. Fixer la culture avec 4% de paraformaldehyde (PFA) pendant 20 min à température ambiante. Retirez la PFA et rincer les puits avec du PBS pendant sept minutes trois fois. </li><li> Après le rinçage final, ajouter 100 ul de solution de blocage (solution saline de phosphate tampon, 5% de sérum de âne normale, 0,4% de sérum albumine bovine et 0,2% de Triton X-100) dans chaque puits d&#39;unee incuber à température ambiante pendant 1 heure. Préparer l&#39;anticorps primaire de lapin anti-Ki67, par dilution dans une solution de blocage à un rapport de travail de 1: 200. </li><li> Retirer la solution de blocage et d&#39;appliquer 100 ul de la solution d&#39;anticorps primaire à chaque puits. Couvrir la plaque à 96 puits et incuber les échantillons à 4 ° C pendant la nuit. </li><li> Le lendemain, retirez la solution d&#39;anticorps et rincer avec du PBS pendant 7 min, 3 fois. </li><li> Préparer l&#39;anticorps secondaire, l&#39;âne anti-lapin Cy3 dans une solution de blocage à un rapport de travail de 1: 500. Ajouter colorant nucléaire DAPI à la solution d&#39;anticorps secondaire à une dilution de 1: 100. Après élimination du dernier rinçage du PBS, 100 ul d&#39;appliquer la solution d&#39;anticorps secondaire / DAPI à chaque puits. Incuber à température ambiante dans l&#39;obscurité pendant 90 min. </li><li> Retirer la solution secondaire d&#39;anticorps / DAPI et rincer chaque puits avec du PBS pendant 7 min, 3 fois. Recouvrir la plaque 96 puits et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à ce que l&#39;imagerie. </li></ol></li><li> PropiDIUM iodure Live / Assay Morte <ol><li> Mesurer la mort des cellules par l&#39;iodure de propidium (PI) un dosage d&#39;exclusion comme décrit ci-dessous. </li><li> Préparer la solution de colorant iodure de propidium à une concentration de 1,5 uM dans du milieu de culture. </li><li> Ajouter 100 ul d&#39;éthanol à 70% à un puits de la MSCs pendant 2 min dans le but de tuer ces cellules. Ce puits sert de contrôle positif pour la tache de PI. La majorité de la PI MSC sera taché indiquant la mort cellulaire. Retirer la solution d&#39;éthanol. </li><li> Ajouter 100 ul de solution de colorant iodure de propidium à chaque puits et incuber pendant 20 min à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. </li><li> Rincer les cellules avec du tampon de phosphate 0,1 M pendant 1 min, deux fois. Fixer les cellules avec 4% de PFA dans 0,1 M de tampon P0 4 pendant 20 min à température ambiante. Retirez la PFA et rincer avec du PBS à trois reprises pendant 7 min. </li><li> Incuber avec une solution de DAPI (1:50) dilué dans une solution de blocage pendant 1 heure à température ambiante. Rincez tous les puits avecPBS pendant 7 min, 3 fois. </li><li> Retirer la solution DAPI et rincer chaque puits avec du PBS pendant 7 min, 3 fois. Recouvrir la plaque 96 puits et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à ce que l&#39;imagerie. </li></ol></li></ol> 4. Analyse Automated Imaging et Multiwavelength notation <ol><li> Chargez une plaque de 96 puits (précédemment traitées pour Ki67 immunomarquage ou l&#39;iodure de propidium teinté) dans le système HCS et laisser la plaque se équilibrer pendant 20 min Ouvrez l&#39;acquisition et l&#39;analyse de l&#39;image système logiciel HCS. </li><li> Choisissez les paramètres d&#39;acquisition pour l&#39;objectif 10X en utilisant la caméra binning à 1 et un réglage de gain de 2. Trouvez la Z-plan dans lequel les cellules se trouvent en utilisant la fonction d&#39;exposition automatique et de calculer le décalage pour chaque longueur d&#39;onde d&#39;intérêt. Pour cette analyse, des images de capture pour DAPI (W1), Cy3 (W2), et FITC (W3). Choisissez le niveau d&#39;intensité maximale à laquelle les puits de contrôle négatif ne montrent pas de signal pour l&#39;acquisition d&#39;images. Confirmez ce paramètre est approprié pour la pospuits itive. </li><li> Acquérir plaque. Capture d&#39;images et de les stocker dans l&#39;acquisition de l&#39;image et la base de données de logiciels d&#39;analyse. </li><li> Une fois les images ont été acquises, image ouverte acquisition et d&#39;analyse de logiciels en ligne et l&#39;examen des données de plaque les images acquises précédemment. </li><li> Sélectionnez l&#39;analyse de notation multi-longueur d&#39;onde. Configurez le minimum et intensités maximales pour chaque longueur d&#39;onde. Remarque: La détection de DAPI devrait marquer la coloration autour de chaque noyau visible. Cy3 doit détecter les cellules positives à Ki67 immunoréactivité (IR) et ne doit pas détecter IR dans les témoins négatifs. Pour Cy3 Ki67 IR, la largeur minimale est d&#39;environ 7 pm, la largeur maximale approximative est de 30 pm, l&#39;intensité au-dessus du fond local était de 150 niveaux de gris, et la zone tachée du minimum est de 50 pm 2. </li><li> Exécuter l&#39;analyse pour tous les postes. Exporter les données à afficher dans un tableur. </li></ol> Suivi 5. cellulaire <ol><li> Ouvrir l&#39;image ACQUISITIOn et programme d&#39;analyse et cliquez sur «Examiner les données des plaques [DB] ...&quot;, en sélectionnant la plaque d&#39;intérêt. </li><li> Voir les données comme &quot;Time vs Eh bien&quot;. </li><li> Choisissez un des sites de la section &quot;Sites&quot; par un clic gauche sur la sélection souhaitée. Sélectionnez &quot;Transmis ...&quot; dans les &quot;longueurs d&#39;onde:&quot;. Faites un clic droit sur la cible et dans le modèle de plaque de 96 puits et cliquez sur «Charger les images&quot;. </li><li> Suivre les cellules en cliquant sur les &quot;Applications&quot;, puis &quot;suivre des objets&quot;. </li><li> Utilisez &quot;Dynamic Data Exchange (DDE)&quot; pour choisir le format d&#39;exporter les données, par exemple, Microsoft Excel. </li><li> Choisissez les données de suivi à l&#39;exportation, par exemple, temps écoulé, nombre d&#39;objets, la distance, intervalle de temps, vitesse, angle absolu, la distance à l&#39;origine, delta x et y delta. </li><li> Marquer chaque cellule d&#39;intérêt avec &quot;touche Ctrl + clic gauche&quot; sur les cellules cibles. </li><li> cellules de piste. Si nécessaire, arrêter / modifier suivi inadéquat des cellules avec la touche &quot;Esc&quot;, puis régler les paramètres. </li><li> Après un suivi de la cellule est complète, enregistrer des données avec &quot;Log Data&quot;. </li></ol>

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Frais de publication de cet article de vidéo ont été pris en charge par Molecular Devices, LLC.

Les cellules souches adultes mésenchymateuses (CSM) sont un type de cellule attrayant pour le développement d&#39;une stratégie expérimentale combinant une thérapie cellulaire et génique basée livraison. MSC sont multipotentes, capables de se différencier en cellules de la lignée mésodermique, et affichent plasticité, différenciation / transdifferentiating en lignées neuronales et gliales avec l&#39;induction appropriée paradigmes 17,18. En outre, les CSM ont été transplantés et prouvé son efficacité dans des études précliniques pour un certain nombre de troubles, y compris les conditions neurodégénératives 19. L&#39;efficacité thérapeutique de cellules souches mésenchymateuses est bien connu en raison de leurs propriétés anti-prolifératives, les activités bénéfiques des anti-inflammatoires et anti-apoptotiques 20. MSCs sont également connus pour produire et sécréter de divers facteurs neurotrophiques et de croissance, ce qui contribue probablement les qualités neuroprotectrices associés aux cellules souches mésenchymateuses naïfs après transplantation à des sites de lésion ou d&#39;une maladie 21. Importantly, MSC peuvent être génétiquement modifiés pour la livraison soutenue de facteurs neurotrophiques pour les applications à base de thérapie cellulaire et de gènes combinés et ont été utilisés dans un certain nombre de modèles animaux de blessure ou de maladie du SNC 11,19,22. Lors de l&#39;élaboration d&#39;une stratégie combinée à base de thérapie cellulaire et génique, il est important que la santé des cellules est évaluée avec soin avant leur utilisation extensive pour in vitro, et en particulier dans les applications in vivo. Comme une preuve de concept, nous avons étudié plusieurs populations de lignes d&#39;ingénierie et de contrôle MSC afin d&#39;étudier les conséquences des modifications génétiques sur la santé et la forme physique de la cellule en utilisant une approche de dépistage teneur élevée (HCS). En général, HCS se réfère à base d&#39;images cellulaire criblage à haut débit 14. Cette approche de dépistage permet une évaluation quantitative des phénotypes cellulaires à plusieurs niveaux de l&#39;espace (cellulaires pour subcellulaire) et temporelles (millisecondes à jour) resolution dans diverses conditions expérimentales. En utilisant cette approche, nous accédé éventuelles différences de préférence de substrat sur les paramètres suivants: la prolifération cellulaire, l&#39;expression de la protéine fluorescente verte (GFP), la mort cellulaire, la motilité cellulaire et / migration. Des expériences ont été conçues en format de plaque de culture cellulaire à 96 puits. Dans une seule plaque nous systématiquement étudié les différences possibles liées substrat à l&#39;égard de chaque paramètre pour les différentes populations de cellules MSC lentivirus transduction et comparé les MSC ingénierie avec l&#39;original, CSM non-transduites. Cela a fourni un moyen de comparer directement les résultats pour les différents sous-types de MSC avec une batterie de tests in vitro tels que la prolifération cellulaire en utilisant Ki67 immunomarquage, morts dosage direct / de la viabilité des cellules en utilisant l&#39;iodure de propidium et le comportement des cellules en effectuant l&#39;imagerie numérique time-lapse . Dans le prolongement de cette HCS on peut également effectuer des tests ELISA sur des échantillons de milieux conditionnés recueillies auprès individuelle waunes de déterminer quantitativement la sécrétion de facteurs neurotrophiques. Le milieu conditionné provenant de différents sous-types de MSC peut également être utilisé dans des essais biologiques in vitro pour déterminer l&#39;activité biologique de facteurs sécrétés 11,23. Ce type de plate-forme HCS peut également être utilisé pour des mesures in vitro de la croissance des neurites à partir de cultures de neurones primaires et des lignées de cellules neuronales souches 24. Dans l&#39;ensemble, nos résultats ont démontré que les sous-populations de cellules souches mésenchymateuses génétiquement modifiées les affichent des comportements similaires en comparaison avec les cellules souches mésenchymateuses non modifiés. L&#39;influence de divers substrats de culture sur la croissance cellulaire et la migration cellulaire ne était pas considérablement différente entre les sous-types de MSC, ainsi que des substrats de culture. En tant que tel, les substrats de la matrice extracellulaire testés ne semblent jouer un rôle essentiel dans la modulation de ces aspects du comportement cellulaire pour ces différents MSC ingénierie. Cette étude démontre l&#39;utilisation d&#39;un système d&#39;analyse pour HCS différent aspects du comportement cellulaire. Cependant, il ne est pas rare de rencontrer des limitations associées à l&#39;analyse d&#39;images. À l&#39;occasion, tout en analysant les images de fluorescence, ce était un peu difficile de déterminer la valeur de seuil au-dessus duquel correcte immunomarquées ou cellules colorées seraient comptés comme positive marquée / teinté. Ainsi, pour minimiser le biais subjective, la détermination de valeurs de seuil est dépendant d&#39;une comparaison avec des témoins (témoins négatifs pour l&#39;imagerie de fluorescence ont été effectuées en parallèle pendant tout le traitement par l&#39;omission des anticorps primaires ou secondaires). Une autre limitation a été rencontrée lors de l&#39;analyse de la migration cellulaire en utilisant l&#39;imagerie numérique lapse. Dans certains cas, le logiciel d&#39;imagerie ne était pas en mesure de différencier entre le mouvement brownien aléatoire d&#39;une cellule contre une cellule fait migrer seulement une très courte distance. Limitations supplémentaires étaient évidentes dans les situations où le logiciel d&#39;analyse ne était pas en mesure de distinguer la présence de multipLe à cellules très près à un autre. Pour surmonter cette sélection cellulaire manuel de prescription requise lors de l&#39;analyse plutôt que l&#39;analyse totalement automatique. La densité cellulaire de placage peut également entraîner biaiser les données de migration cellulaire entre les populations de cellules qui présentent une plus grande préférence à croître en touffes par rapport aux cellules qui se développent dans l&#39;isolement les uns des autres. Ces types de différences sont en partie probablement un reflet de la cellule-substrat en fonction des préférences de cellule à cellule. Utilisation d&#39;un système de HCS à acquérir des images et effectuer une analyse de données fournit un moyen efficace et rapide pour évaluer plusieurs paramètres de maille. En outre, vidéos numériques time-lapse pour 30 différentes conditions (6 substrats et cinq sous-types de différentes MSC) ont été régulièrement acquis pour des périodes allant de quelques heures à quelques jours (48 h) tout en utilisant la chambre de l&#39;environnement. Ces données ont été ensuite utilisées pour calculer et déterminer les différences dans les taux de migration des cellules à travers diverses lignées cellulaires sur ECM différentemolécules. Dans ce rapport, nous avons mis en évidence la mise en œuvre d&#39;une plateforme de criblage à haute teneur pour évaluer la santé et la fonction cellulaire. Ce type d&#39;analyse est utile pour développer des stratégies rationnelles pour la conception de types de cellules, ainsi que les substrats polymères pour faciliter la croissance cellulaire et la régénération neurale dirigée. Ce est une étape essentielle vers l&#39;application de la livraison à base de cellules souches de facteurs thérapeutiques avant vaste dans les études précliniques in vivo en utilisant des stratégies de transplantation cellulaire.

Un problème majeur avec la mise en œuvre des thérapies utiles pour le traitement des troubles du système nerveux est dans le développement de méthodes efficaces qui empêchent encore la dégénérescence et également faciliter la récupération de la fonction. Une stratégie novatrice est de génétiquement des cellules souches ex vivo ingénieur, pour la production de facteurs neuroprotecteurs, avant leur transplantation. Cette combinaison de la thérapie à base de cellules, associé à un type de thérapie génique, fournit un procédé efficace pour le traitement de la maladie ou la mort neuronale induite par accident dans le système nerveux. Les facteurs neurotrophiques sont essentiels pour la croissance et la survie des neurones en développement ainsi que la maintenance et la plasticité des neurones matures. Un certain nombre d&#39;études ont démontré un rôle important de facteurs neurotrophiques pour promouvoir la croissance initiale et la différenciation des neurones dans le système nerveux central et périphérique (SNC et du SNP) et ils peuvent également stimuler la régénération in vitro et dans unNimal modèles de lésion nerveuse 1. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) est fortement exprimé dans le système nerveux central et joue un rôle important dans la régulation du développement neuronal, la plasticité synaptique et la réparation deux. Ligne dérivé des cellules gliales facteur neurotrophique (GDNF) favorise la survie de plusieurs types de neurones dopaminergiques et notamment les motoneurones 3. Ainsi, une stratégie importante pour la réparation de neurones est de fournir des sources exogènes de facteurs neurotrophiques pour les régions lésées ou malades du système nerveux. Cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse multipotentes (MSC) offrent un grand potentiel pour la livraison de protéines thérapeutiques pour traiter le système nerveux endommagé ou malade. La transplantation de cellules souches mésenchymateuses a attiré une attention considérable dans les efforts visant à développer des thérapies à base de cellules compatibles patients car ils ont un certain nombre d&#39;avantages, y compris, 1) la facilité relative de l&#39;isolement et de la maintenance, 2) capacité multipotentielle, 3) petits préoccupations éthiques, 4) La capacité à survivre et à migrer suite à une transplantation et 5) le potentiel de la transplantation autologue 4,5. Des résultats prometteurs ont été rapportés avec l&#39;utilisation des cellules souches mésenchymateuses naïfs et génétiquement modifiées dans des modèles animaux pour un certain nombre de conditions neurodégénératives, y compris les lésions de la moelle épinière 6,7, 8,9 AVC, l&#39;insuffisance de la myéline 10, et la dégénérescence rétinienne 11-13. Le couplage de la transplantation de cellules avec des facteurs neurotrophiques de livraison à partir de cellules souches génétiquement modifiées est une nouvelle et importante stratégie de réparation neurale. Une étape essentielle dans le développement de systèmes d&#39;administration de facteur thérapeutique à base de cellules est de déterminer l&#39;état de santé normal des cellules modifiées. Ainsi, le but principal de cette étude était d&#39;évaluer les paramètres de croissance généraux de cellules souches adultes génétiquement modifiées. Une approche importante pour évaluer rapidement les paramètres cellulaires multiples est d&#39;employer cellulaire haute travers screenin à base d&#39;imagesg (HTS), souvent appelé dépistage contenu aussi élevé (HCS) de 14 procédures. Cette technologie permet l&#39;acquisition automatique d&#39;images et l&#39;analyse et cette approche est particulièrement bien adapté pour les applications de recherche sur les cellules souches. Dans ce projet, nous avons développé une plate-forme de profilage qui permet la caractérisation rapide et l&#39;optimisation des préférences de substrat de cellule et fonctions cellulaires avec des cellules souches adultes par génie génétique en utilisant un système HCS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655090</td>
			<td>96 well plates selected for use in ImageXpress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67 antibody</td>
			<td>Abcam (Cambridge, MA)</td>
			<td>Ab16667</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>C7661</td>
			<td>Collagen from rat tail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&#160;</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL(Entactin-Collagen-Laminin)</td>
			<td>Millipore/Chemicon (Temecula, CA)</td>
			<td>08-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH3007403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Chemistry Store (Ames, IA)</td>
			<td>12003510</td>
			<td>100%, 200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>CB-40008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbeccos Medium (IMDM)</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>P285</td>
			<td>For PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>P288</td>
			<td>For PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY)</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminine (mouse)</td>
			<td>Trevigen (Gaithersburg, MD)</td>
			<td>3400-010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice</td>
			<td>Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA)</td>
			<td></td>
			<td>Isolated from bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF)</td>
			<td>These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&#160;</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>O4042</td>
			<td>4% PFA in 0.1M PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05% (EDTA 1X)</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>12440&#8211;046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridoma-qualified FBS</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH3007403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro</td>
			<td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td>
			<td>ImageXpress micro</td>
			<td>High content screening system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaXpress 4.0</td>
			<td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td>
			<td>MetaXpress 4.0</td>
			<td>Image acquisition and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput characterization of adult stem cells engineered for delivery of therapeutic factors for neuroprotective strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Les paramètres de croissance MSC ont été examinés par la culture des différentes populations de cellules souches mésenchymateuses sur différents substrats. Les cinq populations différentes de sous-types MSC (MSC, GFP-MSC, le BDNF-GFP-MSC, le GDNF-GFP-MSC, et BDNF / GDNF-GFP-CSM) ont été étalées dans des plaques à 96 puits de culture de tissu pré-revêtues de l&#39;autre substrats comme représenté sur la figure 1. Au bout de quatre jours de culture, les plaques ont été fixées et immunomarquées et / ou colorées avec des réactifs appropriés et ensuite examinées en utilisant le système HCS et des analyses effectuées avec l&#39;acquisition d&#39;image et un programme de logiciel d&#39;analyse. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig1highres.jpg" width="650" /> Figure 1:. À 96 puits de la plaque modèle expérimental pour la conception des plaques à 96 puits ont été revêtues avec différents substrats et les puits ont été ensemencées avec des cellules souches usinés comme représenté dans le modèle. A titre d&#39;exemple, seulement wells BF dans les rangées ont été utilisés dans cette expérience. Lignes A, G et H ont été laissés vides. Abréviations - MSC: les cellules souches mésenchymateuses; GFP-MSC: MSC exprimant la protéine verte fluorescente; BDNF-GFP-MSC: dérivé du cerveau MSC facteur exprimant la GFP neurotrophiques; GDNF-GFP-MSC; Gliale cellulaire dérivé MSC facteur exprimant la GFP neurotrophiques; BDNF / GDNF-GFP-MSC; BDNF et GDNF MSC exprimant la GFP; ECL: entactine-collagène IV-laminine). Anti-Ki67 immunomarquage, suivie par contre-coloration au DAPI, a été utilisé pour évaluer si les différents substrats influencés prolifération des différentes populations de cellules souches mésenchymateuses modifiées (Figure 2A). Expression de l&#39;antigène Ki67 produit préférentiellement au cours des phases tardives G 1, S, G2 et M du cycle cellulaire, et ne est pas détectée dans les cellules dans la phase de repos (G 0), et est donc utile en tant que marqueur cellulaire pour la prolifération 15 . 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) est utilisée par un nuContre claire et chromosome qui émet une fluorescence bleu lors de la liaison à AT régions de l&#39;ADN 16. Le nombre total de cellules dans un champ peut être déterminée en comptant le nombre de noyaux colorés au DAPI. Comme illustré sur la figure 2B, bien qu&#39;il y avait une variation dans les pourcentages de cellules souches mésenchymateuses qui prolifèrent, tous les substrats supportés néanmoins la prolifération cellulaire considérable pour chacun des sous-types de MSC. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" width="700" /> Figure 2: analyse de prolifération de cellules Ki67. (A) issu de la fusion, l&#39;image double fluorescent de Ki67 immunomarquage (rouge) et DAPI (bleu) coloration nucléaire. Un grand nombre de cellules souches mésenchymateuses ont été immunomarquées avec l&#39;anticorps Ki67 (rouge). Barre d&#39;échelle = 50 pm. (B) graphe en barres illustrant le pourcentage des sous-types de Ki67 immunomarquées MSC cultivées sur du polystyrène (PS), les poly-L-lysine (PLL), la fibronectine, le collagèneType I, la laminine, le collagène ou l&#39;entactine-IV-laminine (ECL) substrats pendant 5 jours in vitro (DIV). N = une expérience. Chaque barre représente la moyenne des données regroupées à partir de 8 sites imagées de deux puits pour chaque condition. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> L&#39;iodure de propidium (PI) a été utilisé pour la coloration évaluer si différents substrats influencé la survie des cellules (figure 3). L&#39;iodure de propidium est un chromosome nucléaire et contre-coloration rouge fluorescent couramment utilisé. L&#39;iodure de propidium est imperméant de la membrane et généralement exclu de cellules viables, et donc est utile pour détecter des cellules mortes dans une population. La proportion de cellules mortes dans un état donné peut être déterminée lorsqu&#39;il est combiné avec un marqueur nucléaire DAPI général tel que pour identifier toutes les cellules dans un champ. Le pourcentage de cellules PI positif était faible sur tous les substrats examinés (Figure 3). Comme témoin positif pour le réactif de PI, quelques puits contenant des cellules souches mésenchymateuses ont été incubées dans 70% d&#39;éthanol, une condition connue pour tuer la plupart des cellules, résultant en un pourcentage élevé de cellules PI marqué comme illustré sur la figure 3B et 3C (éthanol traitée positif contrôle). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" width="700" /> Figure 3: iodure de propidium dosage de mort cellulaire. (A) issu de la fusion, double image fluorescent pour l&#39;iodure de propidium (rouge) et DAPI (bleu) coloration. Bien que les noyaux de toutes les cellules viables ont été colorées avec du DAPI (bleu), aucune coloration iodure de propidium a été détecté dans le MSC. (B) pratiquement tous les MSC ont été colorées avec de l&#39;iodure de propidium après exposition à 70% d&#39;éthanol. Barres d&#39;échelle de A et B = 100 um. sous-type MSC (C) Bar graphique illustrant les pourcentages de l&#39;iodure de propidium (PI) tachés cultivés sur du polystyrène (PS), le poly-L-lysine (PLL), la fibronectine, le collagène de type I, la laminine, le collagène ou l&#39;entactine-IV-laminine (ECL) substrats pendant 5 jours in vitro (DIV). Contrôle Ethanol: Cette condition a servi de témoin positif pour le réactif de coloration PI. La plupart des cellules soumises à un traitement de l&#39;éthanol PI taches suivantes sont morts et donc colorées positivement pour le réactif de PI. N = une expérience. Chaque barre représente la moyenne des données regroupées à partir de 8 sites imagées de deux puits pour chaque condition. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Pour étudier l&#39;influence possible des différents substrats sur le comportement des cellules souches mésenchymateuses ingénierie, la migration cellulaire a été analysé en utilisant la microscopie numérique time-lapse et le système lumière transmise / chambre environnementale sur le système HCS (voir vidéo supplémentaire 1). Plusieurs sites / puits ont été time-lapse imagéset utilisé pour calculer les taux de migration de cellules pour les différentes sous-populations de cellules souches mésenchymateuses qui poussent sur les différents substrats en utilisant le logiciel d&#39;acquisition et d&#39;analyse d&#39;image. En général, comme représenté sur la figure 4C, les sous-types de cellules souches mésenchymateuses ont montré que le taux de migration la plus rapide sur les surfaces de la matrice extracellulaire (revêtues de fibronectine, le collagène, la laminine et ECL) et le plus lent sur ​​des surfaces non revêtues de polystyrène. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" width="700" /> Figure 4:. Suivi et la migration cellulaire MSC suivis avec l&#39;acquisition de l&#39;image et des logiciels d&#39;analyse. Images qui interfèrent de la lumière transmise et de fluorescence images de (A) le début de l&#39;imagerie time-lapse et (B) à 29 heures plus tard à la fin de la session d&#39;imagerie time-lapse (voir vidéo supplémentaire 1). pistes de migration cellulaire sont indiqués par la li couleurnda. Barre d&#39;échelle:. 50 pm (C) Bar graphique illustrant les taux de migration moyenne (exprimée en um / h) pour les sous-types de MSC augmenté de polystyrène (PS), le poly-L-lysine (PLL), la fibronectine, collagène de type I, la laminine, ou entactine-collagène IV-laminine (ECL) substrats pour deux jours in vitro (DIV). N = une expérience. Chaque barre représente la moyenne d&#39;au moins 10 cellules imagées à partir de deux puits pour chaque condition. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Pris ensemble, ces résultats fournissent des preuves préliminaires que ces sous-populations de cellules souches mésenchymateuses génétiquement modifiés présentent des propriétés de croissance similaires. Ces résultats fournissent des preuves convaincantes que le lentivirus médiée modifications génétiques de ces MSC n&#39;a induit aucun effet délétère détectables dramatiques sur les paramètres de croissance étudiés en utilisant cette plate-forme de criblage. Vidéo supplémentaire 1. Time-lapse vidéo numérique de suivi MSC en utilisant le logiciel d&#39;acquisition et d&#39;analyse d&#39;image. Le chemin de migration est pour deux MSC [indiqués comme 1 (ligne de repérage vert) et 2 (ligne bleue de suivi)] sont illustrés. La vidéo prise pendant une période de 29 h. Les images ont été capturées toutes les 5 min. Des images de fluorescence de cellules souches mésenchymateuses exprimant la GFP a été utilisée pour l&#39;imagerie time-lapse dans la préparation de la vidéo. barre de calibrage = 50 um. Ce type d&#39;analyse est utile pour étudier les comportements cellulaires, y compris la migration cellulaire et la division cellulaire.

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High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

High Throughput Caractérisation des cellules souches adultes d&#39;ingénierie pour la livraison des facteurs thérapeutiques pour les stratégies neuroprotectrices

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A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
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Stem Cell Transplantation Strategies for the Restoration of Cognitive Dysfunction Caused by Cranial Radiotherapy

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation can induce a progressive and debilitating decline in cognition that may, in part, be caused by the depletion of neural stem cells. Given the increased survival of patients diagnosed with brain cancer, quality of life in terms of cognitive health has become an increasing concern, especially in the absence of any satisfactory long-term treatments.
To address this serious health concern we have used stem cell replacement as a strategy to combat radiation-induced cognitive decline. Our model utilizes athymic nude rats subjected to cranial irradiation. The ionizing radiation is delivered as either whole brain or as a highly focused beam to the hippocampus via linear accelerator (LINAC) based stereotaxic radiosurgery. Two days following irradiation, human neural stem cells (hNSCs) were stereotaxically transplanted into the hippocampus. Rats were then assessed for changes in cognition, grafted cell survival and for the expression of differentiation-specific markers 1 and 4-months after irradiation. Our cognitive testing paradigms have demonstrated that animals engrafted with hNSCs exhibit significant improvements in cognitive function. Unbiased stereology reveals significant survival (10-40%) of the engrafted cells at 1 and 4-months after transplantation, dependent on the amount and type of cells grafted. Engrafted cells migrate extensively, differentiate along glial and neuronal lineages, and express a range of immature and mature phenotypic markers.
Our data demonstrate direct cognitive benefits derived from engrafted human stem cells, suggesting that this procedure may one day afford a promising strategy for the long-term functional restoration of cognition in individuals subjected to cranial radiotherapy. To promote the dissemination of the critical procedures necessary to replicate and extend our studies, we have provided written and visual documentation of several key steps in our experimental plan, with an emphasis on stereotaxic radiosurgey and transplantation.

Brain tumor patients routinely undergo cranial radiotherapy, and while beneficial, this treatment often results in debilitating cognitive dysfunction. This serious unresolved problem has at present, no clinical recourse, and has driven our efforts to devise stem cell based therapies for the recovery of radiation-induced cognitive decrements.

Stem Cell Transplantation Stratégies pour la restauration de troubles cognitifs causés par la radiothérapie crânienne

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation ...

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

L&#39;énucléation des yeux de souris à distance pour le phénotypage à haut débit

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Unbiased discovery proteomics strategies have the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve diagnostic and prognostic testing in a clinical setting and may help guide therapeutic interventions. When large numbers of candidate proteins are identified, it may be difficult to validate candidate biomarkers in a timely and efficient fashion from patient plasma samples that are event-driven, of finite volume and irreplaceable, such as at the onset of acute graft-versus-host disease (GVHD), a potentially life-threatening complication of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT).
Here we describe the process of performing commercially available ELISAs for six validated GVHD proteins: IL-2R&alpha;5, TNFR16, HGF7, IL-88, elafin2, and REG3&alpha;3 (also known as PAP1) in a sequential fashion to minimize freeze-thaw cycles, thawed plasma time and plasma usage. For this procedure we perform the ELISAs in sequential order as determined by sample dilution factor as established in our laboratory using manufacturer ELISA kits and protocols with minor adjustments to facilitate optimal sequential ELISA performance. The resulting plasma biomarker concentrations can then be compiled and analyzed for significant findings within a patient cohort. While these biomarkers are currently for research purposes only, their incorporation into clinical care is currently being investigated in clinical trials.
This technique can be applied to perform ELISAs for multiple proteins/cytokines of interest on the same sample(s) provided the samples do not need to be mixed with other reagents. If ELISA kits do not come with pre-coated plates, 96-well half-well plates or 384-well plates can be used to further minimize use of samples/reagents.

High throughput validation of multiple candidate biomarkers can be performed by sequential ELISA in order to minimize freeze/thaw cycles and use of precious plasma samples. Here, we demonstrate how to sequentially perform ELISAs for six different validated plasma biomarkers1-3 of graft-versus-host disease (GVHD)4 on the same plasma sample.

Haut débit séquentiel ELISA pour la validation des biomarqueurs de réaction aiguë du greffon contre l&#39;hôte

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Différenciation isolement, caractérisation et comparative de l&#39;homme dentaires cellules souches de pulpe Dérivé de dents permanentes à l&#39;aide de deux méthodes différentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Imagerie time-lapse de primaires prénéoplasiques cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de cancer du sein

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Etudier le cancer du pancréas Stem Cell Caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Un système organotypiques à haut débit pour la caractérisation de la sensibilité des médicaments cellules du myélome multiple primaire

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

préparation et<em&gt; In vitro</em&gt; Caractérisation des aimanté miR-modifié cellules endothéliales

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

Livraison intradermique de cellules souches thérapeutiques au glioblastome dans un modèle de souris

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...