We thank Dr. Roger Tsien for providing us with the miniSOG constructs. Dr. Xuejun Sun for help with the TEM. Lisa Lem, and Peter Shipple from the Cross Cancer Institute for supplying oxygen. Hilmar Strickfaden holds a postdoctoral fellowship by the Alberta Cancer foundation and was supported by the Bayrische Forschungsallianz. This work was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research and Alberta Cancer Foundation.

1. Génération de miniSOG lignées cellulaires <ol><li> Cultiver U2OS (de l&#39;ostéosarcome humain) des cellules dans une boîte de 35 mm contenant 2 ml de bas glucose milieu d&#39;Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), qui est complété avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 atmosphère. </li><li> Transfecter les cellules quand elles sont confluentes à 80% par lipofection avec la qualité de transfection purifié (A269 / rapport 280 de 1,8 à 2,0) des constructions plasmidiques contenant des séquences pour miniSOG et mCherry étiquetés protéines de réparation selon le protocole du fabricant du réactif de transfection 19. Les plasmides d&#39;expression miniSOG peuvent être commandés à partir du Tsien-Lab: <a href="http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm">http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm</a> </li><li> Trier les cellules exprimant la protéine recombinante avec la balise miniSOG et mCherry par fluorescence tri cellulaire activé deux jours après la transfection. Recueillir des cellulesavec l&#39;intensité de fluorescence intermédiaire afin d&#39;éviter que les cellules sont 20 surexpriment. </li><li> Culture des cellules positives sur une boîte de 10 cm dans 10 ml de milieu DMEM qui est complété avec 10% de FBS et 0,6 ug / ml de l&#39;agent de sélection G418 (généticine). </li><li> Après colonies visibles ont émergé sur les plaques, écran de colonies positives mCherry aide d&#39;un microscope inversé à fluorescence et de dessiner des cercles autour d&#39;eux (sur le fond de la plaque) avec un marqueur permanent. Utilisez un objectif à faible grossissement de l&#39;air (par exemple, 10x) et ramasser clones en utilisant une technique stérile en grattant soigneusement les colonies hors et lentement les aspirant dans une pipette de 1000 pi stérile. </li><li> Développez les colonies sélectionnées et de geler les parties de bas en utilisant le milieu de croissance décrit dans l&#39;étape 1.1 complété avec 10% diméthylsulfoxyde. Testez les cellules pour la formation DRF en les cultivant sur ​​stériles 18 x 18 mm 2 lamelles et en les exposant à2 Gy de rayonnement. Les cellules irradiées exprimant de façon stable un miniSOG mCherry étiquetés protéines de réparation doit montrer le motif caractéristique typique focal CDB quand visualisée avec un microscope à fluorescence en utilisant un filtre-set pour l&#39;imagerie mCherry. </li></ol> 2. Culture cellulaire <ol><li> U2OS cellules de culture exprimant de manière stable le miniSOG et mCherry protéines marquées de réparation dans les conditions décrites dans l&#39;étape 1.1. Cultiver les cellules à 80% de confluence dans une boîte à fond de verre de 35 mm de diamètre contenant 2 ml de DMEM. Assurez-vous que la colle qui attache la lamelle à la matière plastique et le plastique utilisé est résistant aux solutions aqueuses et alcoolisées et résistant à la résine utilisée! </li><li> Avant de procéder à l&#39;expérience, définir un petit espace d&#39;environ 1 mm 2 qui contient des cellules exprimant les protéines ectopiques par grattage avec un stylo à diamant stérile en utilisant un microscope à fluorescence pour déterminer la région d&#39;intérêt. Vous pouvez également utiliser un plat de fond de verre tchapeau contient une lamelle couvre-objet avec un système de grille pré-gravé intégré dans la lamelle. NOTE: Si vous utilisez de haute qualité combinant microscopie corrélative ESI et la fluorescence images microscopiques 21, assurez-vous que l&#39;épaisseur de la lamelle est compatible avec les objectifs d&#39;immersion d&#39;huile. Il devrait avoir l&#39;épaisseur n ° 1.5 (0,16 à 0,18 mm). Choisissez une zone à proximité du centre du plat de la région à être examinée dans le TEM afin d&#39;éviter les problèmes de polymérisation de la résine qui peut se produire à proximité des bords (voir point 04.10 à 04.13). </li></ol> Dommages induction 3. d&#39;ADN <ol><li> Irradier les cellules avec des rayons gamma, en utilisant un médicament radiomimétique ou provoquer des dommages par irradiation micro laser sur un microscope confocal (par exemple, comme décrit dans 18,22 ou 23). </li><li> Dans cet exemple, les cellules à irradier 2 et 6 Gy de rayonnement gamma dans une source de césium-137 ou le rayonnement laser à l&#39;aide du sol microirradiate 405 nmIdentifiant du laser à l&#39;état d&#39;un microscope confocal après la sensibilisation des cellules pendant 20 minutes avec 0,5 ug / ml de Hoechst. </li></ol> Préparation de l&#39;échantillon 4. <ol><li> Fixer les cellules avec 1 ml de paraformaldéhyde 4% prudence dans tampon cacodylate de sodium 0,1 M ou en tampon phosphate 0,1 M pH 7,4 pendant 30 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. ATTENTION: Paraformaldéhyde et cacodylate de sodium sont toxiques! Porter des gants et d&#39;en disposer adéquatement les substances toxiques. </li><li> Laver les cellules deux fois avec 4 ml de tampon cacodylate de sodium 0,1 M pH 7,4 ou du tampon phosphate pH 7,4. </li><li> Traiter les cellules fixées avec 2 ml de glycine 50 mM, 5 mM aminotriazole et 10 mM de cyanure de potassium ATTENTION en sodium 0,1 M tampon cacodylate ou 0,1 M de tampon phosphate (pH 7,4) (vérifier le pH!) Pendant 30 minutes afin de bloquer n&#39;a pas réagi groupes aldéhyde et de supprimer les espèces réactives de l&#39;oxygène générés par des groupes hème, ce qui peut augmenter l&#39;arrière-plan. ATTENTION: le cyanure de potassium est extrêmement toxique! WGants de l&#39;oreille, travailler sous une hotte et évacuer adéquatement les substances toxiques. La réaction est très sensible au pH, il est important que le pH contrôlée et précise. </li><li> Notez la zone qui a été sélectionné à l&#39;étape 2.2 en 2D ou en 3D sur un microscope inversé à fluorescence, si microscopie corrélative est souhaitée. </li><li> Préparer un / ml de solution de chlorhydrate de diaminobenzidine ATTENTION 1 mg en plaçant un comprimé de chlorhydrate de diaminobenzidine 10 mg dans un tube de 2 ml à centrifuger. Ajouter 980 pi de H 2 O distillée et 20 ul d&#39;acide chlorhydrique concentré (11,65 m) et mélanger jusqu&#39;à ce que la solution est brun clair et translucide. Diluer cette solution dans 0,1 M de phosphate ou un tampon cacodylate de sodium 0,1 M à une concentration finale de 1 mg / ml alors que l&#39;ajustement du pH avec de l&#39;hydroxyde de sodium à un pH compris entre 7,0 et 7,6 (pH 7,4 est recommandée). ATTENTION: Diaminobenzidine est toxique! Porter des gants et d&#39;en disposer adéquatement les substances toxiques. </li><li> Pour la photo-oxydation, replace le tampon avec 2 ml d&#39;une solution de chlorhydrate ml 1 mg / diaminobenzidine dans 0,1 M de tampon cacodylate de sodium ou un tampon phosphate. Protéger cette solution de la lumière et laisser refroidir sur de la glace à 4 ° C afin d&#39;augmenter la solubilité de l&#39;oxygène. Saturer la solution avec de l&#39;oxygène par barbotage d&#39;oxygène à travers la solution (en utilisant un tuyau flexible qui est inséré dans la solution et reliée à une bouteille d&#39;oxygène). Vérifier le pH et ajustez si nécessaire. NOTE: Il est essentiel que la réaction de photo-oxydation que le pH est compris entre pH 7,0 et pH 7,6. </li><li> Monter le plat avec les cellules fixées avec précaution sur un microscope inversé à fluorescence équipé d&#39;un objectif 40x à immersion d&#39;huile et le déplacer vers la zone d&#39;intérêt. Exciter le tag miniSOG avec la lumière bleue en utilisant des cubes de filtre pour la GFP ou PCP. MiniSOG a un maximum d&#39;excitation à 448 nm avec un épaulement à 473 nm 10. </li><li> Continuer avec l&#39;illumination même après le vert miniSOG fluorescence has complètement disparu et que le produit de photo-oxydation brune de la diaminobenzidine polymérisé émerge dans le canal de lumière transmise. Lorsque le produit d&#39;oxydation est visible dans la plupart des cellules, désactiver l&#39;éclairage de fluorescence pour arrêter la photo-oxydation. REMARQUE: Photo-oxydation peut prendre plusieurs minutes en fonction de l&#39;objectif, des longueurs d&#39;onde de transmission de filtre et l&#39;efficacité, et la source d&#39;éclairage. </li><li> Postfix les cellules avec 1 ml de glutaraldéhyde à 2% dans du cacodylate de sodium 0,1 M pH 7,4 tampon phosphate ou un tampon pH 7,4 pendant 30 min. </li><li> Fixer les membranes des cellules avec 0,1% -0,5% de tétroxyde d&#39;osmium pendant 20 minutes dans du tampon cacodylate de sodium 0,1 M pH 7,4 ou dans du tampon phosphate 0,1 M pH 7,4. NOTE: Il est recommandé d&#39;utiliser la concentration la plus basse possible de tétroxyde d&#39;osmium nécessaire pour stabiliser les membranes. Étant donné que les précipités DAB polymérisés ont une densité élevée de l&#39;azote, qui peut être détectée directement par ESI, une forteosmium coloration est pas nécessaire d&#39;identifier la protéine miniSOG-marqués et pourrait être préjudiciable à l&#39;ESI. Tétroxyde d&#39;osmium est très toxique! Travailler dans une hotte et d&#39;en disposer de façon adéquate les déchets toxiques. </li><li> Déshydrater, les cellules à travers une série d&#39;éthanol à l&#39;aide de 30%, 50%, 70%, 90%, 98% à 100% des étapes de l&#39;éthanol (5 min chacun). Par la suite, incuber les cellules dans un mélange 1: 1 d&#39;éthanol à 100% et de résine acrylique (LR Blanc) et mettre le plat sur un shaker pendant 4 heures pour faciliter l&#39;infiltration dans les cellules avant incubation des cellules pendant au moins un autre 4 heures dans 100 résine acrylique% (LR Blanc). </li><li> Afin de polymériser la résine, couper le couvercle 2 ml d&#39;un tube de microcentrifugation marquée avec une lame de rasoir et la couche jante avec accélérateur de résine acrylique. Assurez-vous que l&#39;accélérateur ne couvre que la jante et ne coule pas dans le tube. Par la suite, remplissez soigneusement le tube environ les deux tiers avec de la résine LR Blanc aide d&#39;une pipette Pasteur. Veillez à ce que la résine ne soit pas en contact l&#39;esprith l&#39;accélérateur sur la jante! </li><li> Retirer la résine qui a infiltré les cellules dans le plat et placer le plat à l&#39;envers sur le tube vertical microcentrifuge permanente afin que la largeur du tube remplit presque entièrement la fenêtre de la boîte d&#39;observation de verre recouverte. </li><li> Attendre 1 à 2 minutes pour l&#39;accélérateur pour sceller le tube et la lamelle couvre-objet, puis inverser le tube de sorte que la résine dans le tube couvre maintenant les cellules. </li><li> Placer le plat avec le tube dans un four à 60 ° C et le guérir pendant 12 heures. </li><li> Lorsque le bloc est guéri, retirez le plat avec le tube à centrifuger de résine rempli joint du four et séparer le tube de microcentrifugation de l&#39;antenne. Faciliter la séparation par les cycles de gel-dégel dans l&#39;azote liquide et de l&#39;eau chaude. </li><li> Jeter le plat à fond de verre et soigneusement ouvrir le tube à centrifuger avec une lame de rasoir afin d&#39;éliminer le bloc. </li><li> Marquez le bloc avec un marqueur permanent. </li><li> Utiliser une lame de rasoir à trim le bloc de sorte que rien d&#39;autre que la région de 1 mm 2 qui contient la zone préalablement marqué avec le stylet de diamant ou de tungstène (ou la zone contient des cellules d&#39;intérêt) demeure. </li><li> Monter le bloc dans un ultramicrotome, couper le bloc avec un couteau de rognage et couper des sections ultra-minces d&#39;environ 50 nm à l&#39;aide d&#39;un couteau de diamant. </li><li> Ramassez les sections sur une transmission élevée de 300 grilles de maille. Ces grilles ont de très petits barreaux de grille et portent donc moins de cellules dans la zone d&#39;intérêt. </li><li> Enduire les sections sur les grilles avec environ 0,2-0,4 nm du carbone à l&#39;aide d&#39;une coucheuse de carbone pour aider à stabiliser les sous le faisceau d&#39;électrons du TEM. </li></ol> 5. Electron Microscopy <ol><li> Charger les grilles dans un TEM qui est équipé d&#39;un filtre d&#39;énergie. Après mise au point du microscope et le filtre d&#39;énergie selon les instructions du fabricant, inspecter les cellules sur les articles dans le mode de grossissement faible (transmission normale) et comparerleur fluorescence données le cas échéant (obtenu à l&#39;étape 4.4). </li><li> Une fois un noyau avec des caractéristiques intéressantes (dommages à l&#39;ADN de la piste ou de réparation de l&#39;ADN foyers) est trouvé, passez en mode de filtrage d&#39;énergie et d&#39;enregistrer une carte d&#39;épaisseur. Remarque: Cette procédure comprend l&#39;enregistrement d&#39;un-zéro perte et une image non filtrée. Épaisseurs allant jusqu&#39;à 0,3 libre parcours moyen (30% des électrons du faisceau incident se diffusée par l&#39;échantillon) sont suffisamment minces pour générer de bonnes cartes élémentaires. </li><li> Rapport de la fiche de carte de l&#39;azote et du phosphore des éléments en utilisant le logiciel qui commande le filtre d&#39;énergie du microscope utilisé. Enregistrez la carte de phosphore après pointe images à 175 eV perte d&#39;énergie avec une largeur de fente de 20 eV et pré-gardistes images à 120 eV perte d&#39;énergie, également avec une largeur de fente de 20 eV. Pour les cartes d&#39;azote, d&#39;enregistrer des images après de pointe à 447 eV avec une largeur de fente de 35 eV et pré-garde des images à 358 eV, également avec une largeur de fente de 35 eV. NOTE: Comme le contenu des éléments imagés (phosphOrus et d&#39;azote) est relativement faible (env. 1%), choisissez &quot;Rapport d&#39;image&quot; (carte élémentaire qualitative) sur la «méthode 3 de fenêtre&quot; (quantifier carte élémentaire) dans le but de générer des images avec un meilleur rapport signal sur bruit. </li></ol> 6. Traitement de l&#39;image <ol><li> Ouvrez les cartes de rapport élémentaires dans un logiciel de traitement d&#39;image qui peut gérer le format de fichier des images acquises (par exemple, Microscopie numérique). Copiez la carte de l&#39;azote dans le canal rouge et le plan de phosphore dans le canal vert d&#39;une image RVB, puis superposer et aligner les cartes. </li><li> Exporter l&#39;image composite comme un format de fichier d&#39;image étiqueté (TIFF) fichier. Ouvrez l&#39;image dans un logiciel de traitement d&#39;image qui peut utiliser des couches (par exemple, Photoshop). </li><li> Ajustez la plage dynamique de chaque canal en rééchelonnant le minimum et maximum dans l&#39;image à un ensemble de données de 8 bits (0 à 255). </li><li> Soustraire la teneur en phosphore à partir de la carte d&#39;azote (en utilisant leFenêtre &quot;Layers&quot;) afin de générer une carte qualitative qui montre la répartition des protéines. </li><li> Convertir les cartes de l&#39;acide nucléique (phosphore) et la protéine (azote) créé à l&#39;étape précédente en «couleurs indexées&quot; et de créer une table de consultation jaune dans l&#39;espace de couleur CMYK pour voir la carte montrant la répartition de l&#39;acide nucléique et une table cyan de recherche montrer la carte non-nucléoprotéine. Les couleurs sont choisies pour produire un contraste maximal entre les deux cartes élémentaires. </li><li> Créer une nouvelle image et d&#39;importer les cartes montrant les distributions de phosphore et de protéines que les différentes couches. Utilisez le mode de la transparence &quot;de l&#39;écran&quot; afin de voir les deux couches superposées les unes aux autres. </li><li> Ouvrez l&#39;image sans perte acquise dans l&#39;étape 5.2. Cette image représente une image de la zone enregistrée qui ressemble à une image TEM classique, mais ne contient que les électrons qui ont traversé l&#39;échantillon sans entrer en collision avec le spécimen. Exportcette image comme une image TIFF. </li><li> Ouvrez l&#39;image exportée de zéro perte dans un éditeur de photo et copiez-le dans la couche supérieure de l&#39;image montrant la carte élémentaire. Alignez l&#39;image en utilisant le mode de la transparence &quot;de l&#39;écran&quot;. </li><li> Facultativement, le seuil de l&#39;image sans perte de segmenter le signal qui provient de la miniSOG. Ajouter l&#39;image résultante comme une couche séparée comme décrit ci-dessus. </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+repressive+complex+2+contributes+to+DNA+double-strand+break+repair.">Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair.</a> Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).</li><li>Mortusewicz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+RNA+polymerase+II+cofactor+PC4+to+DNA+damage+sites.">Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites.</a> J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).</li><li>Bekker-Jensen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+mammalian+genome+surveillance+machinery+in+response+to+DNA+strand+breaks.">Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks.</a> The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).</li><li>Ferrando-May, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlighting+the+DNA+damage+response+with+ultrashort+laser+pulses+in+the+near+infrared+and+kinetic+modeling.">Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling.</a> Frontiers in genetics. 4, 135 (2013).</li><li>Lukas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+nuclear+bodies+form+around+DNA+lesions+generated+by+mitotic+transmission+of+chromosomes+under+replication+stress.">53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress.</a> Nature. 13, 243-253 (2011).</li><li>Harrigan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+stress+induces+53BP1-containing+OPT+domains+in+G1+cells.">Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells.</a> The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).</li><li>Aronova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprint+of+'Three-dimensional+elemental+mapping+of+phosphorus+by+quantitative+electron+spectroscopic+tomography+(QuEST).">Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST).</a> J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).</li><li>Fussner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+heterochromatin+reorganization+during+somatic+cell+reprogramming.">Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming.</a> The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).</li><li>Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KAP1+depletion+increases+PML+nuclear+body+number+in+concert+with+ultrastructural+changes+in+chromatin.">KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin.</a> Cell cycle. 10, 308-322 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ESI peut servir comme un excellent outil pour examiner les différents états de la chromatine et ribonucléoprotéines dans le noyau, car il est capable de cartographier précisément les zones qui sont riches en phosphore. Il augmente profondément la quantité de détails qui peut être obtenue par un microscope électronique et ne dépend pas de méthodes non spécifiques contrastées. Un inconvénient de ESI est qu&#39;il nécessite des sections plus minces que TEM conventionnelle à la même tension d&#39;accélé...

Malgré les avancées significatives dans la microscopie optique au cours des dernières années 1, biologistes cellulaires souffrent encore d&#39;une lacune dans la résolution. Cela limite la compréhension des relations structure-fonction dans les processus cellulaires fondamentaux qui impliquent l&#39;interaction coordonnée entre les complexes macromoléculaires (par exemple, dans le remodelage de la chromatine, la réparation d&#39;ADN, la transcription d&#39;ARN et la replication d&#39;ADN). Bien que des microscopes électroniques à transmission (MET) s fournir la résolution requise, il a été difficile de définir ces processus structurellement en raison de l&#39;incapacité à marquer les protéines spécifiques tout en étant capable de déterminer la composition biochimique des structures visualisées. En l&#39;absence de membranes internes pour aider à différencier les structures nucléaires, le noyau a été particulièrement difficile. Electron imagerie spectroscopique (ESI) permet de résoudre certaines de ces limitations en permettant la détection simultanée et la différenciation de l&#39;ADN, de l&#39;ARN, et protein-base structures nucléaires 2-5. Electron imagerie spectroscopique: Afin de cartographier la distribution des éléments à haute sensibilité et une résolution dans le microscope électronique, on peut utiliser un spectromètre d&#39;imagerie qui sélectionne les électrons qui ont été inélastique par des interactions avec les électrons de coque intérieure d&#39;un élément dans l&#39;échantillon 6. En raison des quantités spécifiques d&#39;énergie éléments sont perdues à la suite de l&#39;ionisation d&#39;atomes dans l&#39;échantillon, ces électrons peuvent être séparées et visualisées en utilisant un spectromètre qui est attaché à la microscopie électronique. Ainsi, l&#39;analyse du spectre des électrons qui ont interagi avec l&#39;échantillon révèle des informations qualitatives et quantitatives sur la composition élémentaire de l&#39;échantillon 7. Les électrons qui ne perdent pas d&#39;énergie lors du passage à travers l&#39;échantillon se trouvent dans le &quot;pic sans perte» de la perte d&#39;énergie d&#39;électronsspectre. L&#39;abondance de ces électrons est lié à la masse, la densité et l&#39;épaisseur de l&#39;éprouvette et est constitué d&#39;électrons qui passent à travers l&#39;échantillon sans entrer en collision avec l&#39;échantillon ou la perte d&#39;énergie lors du passage à travers l&#39;échantillon. Cette information peut être utile pour la quantification absolue des nombres d&#39;atomes d&#39;un élément spécifique présent dans l&#39;échantillon 8. Depuis échantillons biologiques sont essentiellement des éléments légers qui dévient mal les électrons dans le faisceau incident de TEM, les méthodes de coloration utilisant sels de métaux lourds doivent être appliquées afin de générer contraste dans l&#39;échantillon. Le manque de spécificité de la plupart de ces agents de contraste et de l&#39;incapacité de visualiser plus d&#39;une tache où la spécificité est possible a limité la valeur de la microscopie électronique conventionnelle dans l&#39;étude du noyau. ESI possède des avantages significatifs sur TEM classique, en particulier pour l&#39;étude des structures du noyau de la cellule.Il est possible d&#39;exploiter la nature riche en phosphore de l&#39;ADN et de complexes macromoléculaires contenant de l&#39;ARN à distinguer des complexes de nucléoprotéine de complexes de protéines et de résoudre les différents complexes de nucléoprotéine en fonction de leur densité d&#39;acides nucléiques. Le matériau biologique restant peut être imagée sur la base de l&#39;abondance de l&#39;azote. Cartographie seulement ces deux éléments et l&#39;analyse de leur distribution et l&#39;abondance relative au sein de différentes structures anatomiques nous fournit beaucoup d&#39;informations sur le noyau. Par exemple, il est facile d&#39;identifier la chromatine et les ribosomes dans la carte représentant l&#39;abondance de phosphore. L&#39;espace de interchromatiniens, des complexes de pore nucléaire, corps nucléaires et, d&#39;autre part, peuvent être facilement détectés dans l&#39;image de mappage d&#39;azote. Système générateur d&#39;oxygène singulet Mini (miniSOG) Bien ESI représente une technique puissante pour étudier la structure de la chromatine in situ car il prendres avantage des rapports caractéristiques entre dans la composition élémentaire de l&#39;azote et du phosphore, la composition élémentaire ne peut normalement pas être utilisé pour établir une discrimination entre les différentes populations de complexes protéiques. Les anticorps marqués avec de petites particules d&#39;or dans la plage du nanomètre ont été largement utilisés pour cartographier l&#39;emplacement des molécules individuelles. Depuis la particule d&#39;or est généralement fixé à un anticorps secondaire, il apparaîtra dans une circonférence d&#39;environ 20 nm autour de l&#39;épitope détecté par l&#39;anticorps primaire. Dans les échantillons de post-enrobage, les anticorps peuvent uniquement détecter les epitopes qui sont exposés à la surface des sections. Bien qu&#39;il soit possible de prouver la présence d&#39;un antigène et le relier à une certaine structure anatomique de la cellule, l&#39;information qui est obtenue est incomplète, car la plupart des epitopes sont obscurcies par de la résine. Techniques, qui utilisent des protocoles similaires à ceux utilisés pour la microscopie par fluorescence pré-enrobage, pour permettre l&#39;accès à travers les antigènestoute la profondeur de l&#39;échantillon, mais les étapes de perméabilisation qui sont nécessaires pour permettre à l&#39;anticorps de pénétrer dans la cellule nécessite généralement l&#39;enlèvement de membranes lipidiques et éliminer les composants qui ne peuvent être résolus par des aldéhydes. De plus, le fixateur d&#39;aldéhyde préféré pour la préservation du ultrastructure, le glutaraldéhyde, des epitopes communément détruit et, par conséquent, le paraformaldéhyde est généralement nécessaire. Ceci est moins efficace pour la reticulation protéine-protéine. Un autre inconvénient des anticorps qui sont marqués avec une nanoparticule d&#39;or est que l&#39;or est un matériau dense aux électrons qui crée un très fort contraste qui peuvent masquer des détails de structure intéressants de l&#39;échantillon, qui présente contraste plus faible. L&#39;émergence de la protéine fluorescente verte (GFP) comme une étiquette de protéine exprimée a transformé l&#39;utilisation de la microscopie à fluorescence pour répondre aux questions en biologie cellulaire. Tagging une protéine avec un petit domaine fluorescente permet la cartographie de sa distribution in vivo </em&gt; sans la nécessité de procédures de perméabilisation qui peuvent altérer la structure. Pour traduire le principe de l&#39;utilisation de mots-clés élégant de protéines pour cartographier les distributions de protéines dans une cellule pour la microscopie électronique, a besoin d&#39;un système qui est capable de produire un signal à proximité de la structure d&#39;intérêt et générer contraste dans le TEM. Diaminobenzidine polymérisé est un colorant qui est souvent utilisé en histologie pour détecter la liaison d&#39;anticorps. Cette tache est habituellement déposé en utilisant la peroxydase de raifort (HRP) conjuguée à un anticorps secondaire. Bien que la réaction produit un résultat fiable, la HRP est catalytiquement actif non dans le cytosol des cellules 9. Les produits de réaction de HRP peut aussi diffuser hors du site de génération de sorte que leur résolution est pire que la méthode de Nanogold 10. Afin de contourner ces problèmes, le système / ReAsH flash a été développée 11. Il se compose de protéines de fusion recombinantes qui possèdent un motif tétracystéine. Ce motif permet de liaisonbiarsenic un fluorophore. Quand il est excité, le flash est lié ou ReAsH capable de générer de l&#39;oxygène singulet hautement réactif et donc photoconvert diaminobenzidine (DAB) dans un polymère qui précipite immédiatement sur le site des protéines marquées. Le polymère de DAB peut être coloré avec du tétroxyde d&#39;osmium, qui est électrons dense et donc peut être utilisé pour cartographier la distribution de la protéine de fusion recombinante dans le TEM. En 2011, Shu et al. 10 ont présenté le système miniSOG, qui se compose d&#39;un petit 106 amino tag acides de fusion dérivé d&#39;un flavoprotéine d&#39;Arabidopsis qui est fluorescente et capable de créer de nombreux radicaux oxygène singulet lorsqu&#39;il est excité à 448 lumière bleue nm. Ces radicaux singulet d&#39;oxygène peuvent être utilisés pour oxyder photo-diaminobenzidine pour former des polymères sur la surface et près de la protéine marquée, ce qui est considérablement plus étroite que les anticorps marqués 11 immunologique. Bien que le système FLASH / ReAsH nécessite portant le fluorole chrome et le diaminobenzidine dans les cellules avant de faire la photoconversion, le système ne nécessite que miniSOG diaminobenzidine et de la lumière et en plus est environ deux fois plus efficace à la polymérisation diaminobenzidine. Ici, miniSOG est utilisé en combinaison avec ESI afin de cartographier l&#39;ultrastructure de réparation de l&#39;ADN foyers. Réparation de l&#39;ADN foyers (DRF) ADN non réparé des cassures double brin constituent une grave menace à la cellule, car ils peuvent conduire à des translocations et la perte de l&#39;information génétique. À son tour, cela peut conduire à la sénescence, le cancer et la mort cellulaire. Beaucoup de protéines qui sont impliquées dans l&#39;ADN réparation des cassures double brin accumulent dans les foyers que assembler autour d&#39;un double brin d&#39;ADN briser 12-14. Bien que leur fonction ne soit pas connu, ils représentent le site dans le noyau qui contient le double rupture de brin d&#39;ADN et est le site de l&#39;ADN double brin réparation des cassures. Réparation de l&#39;ADN foci (DRF) ont été caractérisés par microscopie à fluorescence et ils servir de biomarqueurs pour dommages à l&#39;ADN 12,15. Ils sont énormes par rapport à la taille de la cassure double brin et ont été considérés comme relativement homogène jusqu&#39;à ce que des études récentes de microscopie de super-résolution ont révélé des preuves de sous-cloisonnement des molécules au sein de chaque concentrent 16. Afin de comprendre comment ces sites sont organisées, il est nécessaire de visualiser toutes les structures biologiques sous-jacents rapport à l&#39;autre. Cela ne peut être obtenu par microscopie à fluorescence, mais est possible grâce à la microscopie électronique 17,18. Ici, on décrit un procédé qui combine électronique imagerie spectroscopique avec la méthode miniSOG pour illustrer le potentiel de cette approche combinée pour explorer l&#39;ultrastructure de double brin de réparation des cassures de l&#39;ADN.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gridded 35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-2-14-CGRD&#160;</td>
			<td>not made for immersion objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White: acryl resin</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>14381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White accelerator</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>14385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim Bar Grids 300 Mesh</td>
			<td>SPI</td>
			<td>1161123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten-Point Lab Pen</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>41148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Coater 208carbon</td>
			<td>Cressington</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra microtome Leica EM UC6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS5</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>might even work with older versions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Micrograph V.2.30</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td>might even work with older versions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSOG-Constructs</td>
			<td>Tsien-Lab</td>
			<td></td>
			<td><a href="mailto:tsienlab@yahoo.com">tsienlab@yahoo.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDC1 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>53BP1 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rad52 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cesium 137 radiation source &#34;MARK 1&#34;</td>
			<td>&#160;(J.L. Shepherd &#38; Associated)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FiJi</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>http://fiji.sc/Fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Knife ultra 35&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming Knife ultratrim</td>
			<td>Diatome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>12300</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde EM Grade 8%</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>16020</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>21180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>21190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 4% solution</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>A142-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Solution 10M</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>Medigas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Amino-1,2,4-triazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium cyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>207810</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>15058</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade Single Edge Carbon Steel</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>71960</td>
			<td>Caution Sharp!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>lifetechnologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>lifetechnologies</td>
			<td>11811-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope 200 kV</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GIF Tridiem 863 Energy filter</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of minisog tagged dna repair proteins in combination with electron spectroscopic imaging (esi)

Les limites de résolution optique et le défi de l&#39;identification des populations de protéines spécifiques dans microscopie électronique en transmission ont été des obstacles en biologie cellulaire. Plusieurs phénomènes peuvent pas être expliqués par une analyse in vitro dans des systèmes simplifiés et ont besoin d&#39;une information structurelle supplémentaire in situ, en particulier dans la plage comprise entre 1 nm et 0,1 pm, de manière à être entièrement compris. Ici, l&#39;imagerie spectroscopique électronique, une technique de microscopie électronique en transmission qui permet la cartographie simultanée de la distribution des protéines et des acides nucléiques, et une étiquette d&#39;expression, miniSOG, sont combinés pour étudier la structure et l&#39;organisation de l&#39;ADN double brin réparation des cassures foyers.

ESI En comparant les images du noyau ESI (figure 1) avec les images de TEM classiques (par exemple, la figure 1.7) révèle une augmentation spectaculaire des structures anatomiques qui peuvent être facilement distingués. Les crêtes de la chromatine apparaissent en jaune et il est assez facile d&#39;identifier les chromocentres dans les cellules de souris. Nucléoles peut être facilement distinguée de ...

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Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Visualisation des miniSOG protéines marquées de réparation d&#39;ADN en combinaison avec Electron imagerie spectroscopique (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

10.0K vues.  University of Alberta. Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

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Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

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Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

À haut débit Affinity Purification de protéines recombinantes-étiquette

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Visualisation de l&#39;ATP synthase dimères dans les mitochondries par cryo-tomographie

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imagerie en temps réel de l&#39;unité d&#39;ingénierie des ARN transcrits dans des cellules vivantes utilisant Ratiométrique bimoléculaires Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

La visualisation de la surface captif grande molécules d&#39;ADN avec un ADN fluorescent protein peptide de liaison

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

Visualisation de Compaction de l’ADN chez les cyanobactéries par haute tension Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

Visualisation de l’ADN Réparation des protéines Interaction par immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light represents a revolutionary advance for studies of the neural basis of behavior. However, a downside of this development is its tendency to focus investigators on a very small number of &#8220;designer&#8221; organisms (e.g., C. elegans and Drosophila), potentially negatively impacting the pursuit of comparative studies across many species, which is needed for identifying general principles of network function. The present article illustrates how optical recording with voltage-sensitive dyes in the brains of non-transgenic gastropod species can be used to rapidly (i.e., within the time course of single experiments) reveal features of the functional organization of their neural networks with single-cell resolution. We outline in detail the dissection, staining, and recording methods used by our laboratory to obtain action potential traces from dozens to ~150 neurons during behaviorally relevant motor programs in the CNS of multiple gastropod species, including one new to neuroscience &#8211; the nudibranch Berghia stephanieae. Imaging is performed with absorbance voltage-sensitive dyes and a 464-element photodiode array that samples at 1,600 frames/second, fast enough to capture all action potentials generated by the recorded neurons. Multiple several-minute recordings can be obtained per preparation with little to no signal bleaching or phototoxicity. The raw optical data collected through the methods described can subsequently be analyzed through a variety of illustrated methods. Our optical recording approach can be readily used to probe network activity in a variety of non-transgenic species, making it well suited for comparative studies of how brains generate behavior.

This protocol presents a method for imaging neuronal population activity with single-cell resolution in non-transgenic invertebrate species using absorbance voltage-sensitive dyes and a photodiode array. This approach enables a rapid workflow, wherein imaging and analysis can be pursued over the course of a single day.

Imagerie optique basée sur des photodiodes pour l’enregistrement de la dynamique des réseaux avec une résolution mononeurone chez les invertébrés non transgéniques

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...