L’immunofluorescence indirecte permet de détecter les protéines de réparation de l’ADN, les photos du recrutement spatial et temporel et elle aide à interroger les interactions proteinprotein sur le site des dommages à l’ADN. Suite à des dommages à l’ADN, les protéines de réparation de l’ADN sont recrutées à l’insulte de l’ADN tandis que leur concentration augmente localement, et ils forment des groupes appelés foyers qui peuvent être visualisés par immunofluorescence indirecte sur des échantillons fixes. Cette technique peut être utilisée pour détecter les foyers protéiques, ainsi que pour quantifier la colocalisation du présent dans les cellules.
Cela peut aider à expliquer la séquence des événements nécessaires à la formation complexe et à la réparation de l’ADN. des interactions protéinées particulières peuvent être associées à de telles expériences. La démonstration de la procédure sera Barbara De La Pena, une photo postdoc très talentueux de mon laboratoire Commencer par la croissance de 40.000 cellules HeLa dans chaque bien plus de 12 plaque de puits avec un 18 millimètres de couverture en verre rond coverslip à 80% confluency.
Après avoir exposé les cellules à quatre irradiations gamma grises, lavez-les deux fois avec un millilitre de PBS. Retirez ensuite complètement le PBS et ajoutez 200 microlitres de NDB à chaque puits. Incuber les cellules pendant deux minutes à température ambiante, puis retirer la BND.
Gardez à l’esprit que le temps d’incubation peut varier en fonction de la lignée cellulaire, mais ne doit généralement pas dépasser deux minutes. Lavez les cellules avec un millilitre de PBS. Retirez ensuite complètement le PBS et ajoutez 200 microlitres de 4%PFA à chaque puits pour la fixation cellulaire.
Incuber les cellules pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Retirez ensuite le PFA et ajoutez un millilitre de PBS à chaque puits. Retirez complètement le PBS, puis ajoutez 200 microlitres de solution de blocage à chaque puits et incubez les cellules pendant deux heures à température ambiante ou de 16 à 18 heures à quatre degrés Celsius.
diluer le tampon primaire d’anticorps et de dilution et le vortex jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé dans une boîte d’humidité et ici un morceau de parafilm et ajouter 10 microlitres d’anticorps primaires en une seule goutte. Alignez un bord du coverslip du puits avec la goutte et abaissez-le lentement sur le parafilm répandant le liquide. incuber le coverslip pendant deux heures à température ambiante.
Après le lavage d’incubation, le couvercle glisse trois fois dans PBS pendant une minute par lavage. diluer l’anticorps secondaire et le tampon de dilution et le vortex jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé appliquer 10 microlitres d’anticorps secondaires à chaque coverslip comme précédemment décrit et l’incuber pendant deux heures à température ambiante protégée de la lumière. Laver le couvercle glisse trois fois avec PBS et une fois avec de l’eau pendant une minute par lavage.
Montez-les ensuite sur des toboggans en verre avec un support de montage à base de glycérol contenant des glissements de couvercle de joint DAPI avec du vernis à ongles transparent et laissez-les sécher pendant 20 minutes. Placez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif de 60 x et utilisez DAPI pour localiser les noyaux à travers l’oculaire pour l’acquisition d’images XYZ, ouvrir le logiciel d’acquisition et définir le type de scanner comme galvano le type de scanner comme aller-retour et 512 par 512 taille d’image. Dans le mode de jeu de panneau PMT à la moyenne VBM à l’encadrement et l’analyse séquentielle à la ligne.
Ensuite, réglez le colorant et les détecteurs de chaleur réglé canal un à DAPI et SD un, canal deux à alexafluor 488 et HSD trois, et canal trois à alexafluor à 647 et HSD quatre sélectionner sur Z.To ajuster l’image en direct, appuyez sur le bouton en direct sur la fenêtre en direct et ajuster la mise au point. Ensuite, utilisez la fenêtre d’outil PMT pour définir la sensibilité à l’intensité laser, gagner et compenser pour les piles z, sélectionnez début à fin et 15 tranches. Sélectionnez le dossier pour enregistrer des images et appuyez sur le bouton Démarrer LSM pour commencer à acquérir.
Une fois terminé, appuyez sur le bouton de la série fait pour compléter l’acquisition de l’image. Ouvrez le logiciel d’analyse puis appuyez sur la fenêtre de l’outil de lot et sélectionnez les images à analyser. Rendez-vous à la fenêtre de l’outil d’analyse et sélectionnez projection, qui affichera la projection d’intensité maximale à partir de 15 tranches.
Dans le paramètre de sortie d’entrée, sélectionnez le lot créé et le dossier de sortie. Processus de presse pour que les images soient traitées et exportent les images sous forme de fichiers TIFF. Effectuer la quantification nucléaire avec cellprofiler selon les instructions manuscrites.
Les cellules non traitées avec le rayonnement présentent très peu de signes gamma H2AX expo. En l’absence de protéines essentielles de réparation de l’ADN, l’accumulation gamma de H2AX peut être observée lors des ruptures d’ADN. L’accumulation de ruptures non réparées peut conduire les cellules à devenir pré hypotoniques indiquées par les noyaux gamma solides H2AX.
Après l’irradiation, les noyaux présentent un grand nombre de ruptures à double brin auxquelles le gamma H2AX se localise est extrêmement rapide. Bien que peu ou pas de foyers soient observés en l’absence d’un rayonnement, le nombre de foyers a été quantifié à une heure deux quatre et 16 heures après un rayonnement et pour la lutte contre les radiations de la NDA. Selon la question biologique soulevée et le type de données requises, différentes options de traçage devraient être considérées Comme la colocalisation peut être étudiée en multiplexant les anticorps primaires élevés chez différentes espèces animales et en utilisant des anticorps secondaires, sont étiquetés avec des fluorophores distincts.
Superposition de vert et rouge, donne lieu à des points chauds jaunes, les deux protéines d’intérêt sont présents dans les mêmes pixels. L’analyse quantitative de la colocalisation peut être réalisée par une approche basée sur l’objet ou par une approche statistique qui effectue des analyses basées sur le coefficient de corrélation d’intensité. Une combinaison d’anticorps primaires élevés chez différentes espèces animales, peut être utilisée dans ce protocole.
Assurez-vous que les anticorps sont compatibles et n’interfèrent pas les uns avec les autres. Vous devez définir correctement l’anticorps secondaire à utiliser contre chacun des anticorps primaires et tenir compte d’un chevauchement spectral particulier lors de la sélection de la force moins à utiliser. La colocalisation ou les protéines indiquent des interactions directes possibles.
Ceci peut être vérifié par précipitation granulaire dans les cellules, ou par mise vers le bas directe utilisant des protéines purifiées in vitro.
