Nous tenons à remercier le personnel administratif de CIBIO (Université de Trento) et CNR Institut des Neurosciences de l&#39;aide. Giovanni Provenzano est soutenu par une bourse post-doctorale de Fondazione Veronesi (Milan, Italie). Ce travail a été financé par le ministère italien de l&#39;Université et de la Recherche (PRIN 2008 subvention # 200894SYW2_002 et PRIN 2010-2011 subvention # 2010N8PBAA_002 à YB), Université de Trente (CIBIO subvention à YB start-up) et la Fondation Téléthon (# subvention de GGP13034 à YB).

Toutes les expériences ont été effectuées en conformité avec la directive européenne 2010/63 / UE et ont été approuvés par le ministère italien de la Santé. 1. Animal Care, du logement et de traitement <ol><li> Effectuer tous les protocoles expérimentaux utilisant des souris en conformité avec les lignes directrices de la protection des animaux respective. </li><li> Maintenir les animaux dans un 12 hr cycle lumière / obscurité avec de la nourriture et de l&#39;eau ad libitum. </li><li> Maison de la souris en groupes de 2-4, dans des cages polycarbonate souris de taille standard avec la sciure de bois et de matériaux de litière changé chaque semaine. </li><li> Utilisez l&#39;âge et du sexe des souris assortie, parce que la susceptibilité à la maladie peut varier avec l&#39;âge et le sexe dans les modèles de troubles du développement neurologique de souris différentes. </li><li> Choisissez un nombre approprié d&#39;animaux pour atteindre une signification statistique (un minimum de 10 souris par génotype pour l&#39;étude comportementale et 4 souris par génotype pour l&#39;expérience de l&#39;immunohistochimie). </li></ol> 2. Morris Maze eau (MWM) <ol><li> Utilisez un réservoir circulaire (diamètre 100 cm, hauteur 50 cm). <ol><li> Placez quelques repères visuels sur les cloisons autour du réservoir. </li><li> Placer une plate-forme de 10 cm de diamètre dans le réservoir à un emplacement fixe dans le centre de l&#39;un des quatre quadrants imaginaires. Gardez la plate-forme cachée dans le même quadrant pour tous les essais dans toutes les sessions de formation. </li><li> Remplissez la piscine avec de l&#39;eau du robinet jusqu&#39;à la plate-forme est de 1 cm au-dessus de la surface de l&#39;eau. Equilibrer la température de l&#39;eau devrait être proche de 22 ° C; cette étape peut prendre plusieurs heures. Ajouter de l&#39;eau chaude pour raccourcir le temps nécessaire pour équilibrer la température de l&#39;eau. </li><li> Ajouter environ 1,5-2 L de blanc, la peinture non toxique pour rendre l&#39;eau opaque. </li></ol></li><li> Piste procédure d&#39;acquisition <ol><li> Mettre en place le système de suivi de MWM avec des caméras CCD standard et les cartes vidéo. Choisissez un système de vidéo-tracking pour suivre et analyser plusieurs variables telles que la longueur du trajet, escape latence, et le temps passé dans chaque quadrant. </li><li> Diviser l&#39;arène en quatre quadrants et régler les paramètres de détection pour assurer un contraste optimal entre les animaux et pour le suivi en direct de fond. </li><li> Spécifiez la région de la plate-forme. </li><li> Réglez le temps d&#39;essai maximale de 60 sec. </li></ol></li><li> Test MWM <ol><li> Avant le test de comportement, permettra souris une période d&#39;adaptation de 20-25 min dans une zone où ils ne peuvent pas voir la piscine ou de repères spatiaux. </li><li> Former chaque souris pendant 9 jours (deux essais consécutifs par jour, avec intervalle de 20-30 min entre eux). </li><li> Allumez l&#39;ordinateur et l&#39;appareil photo et lancer le logiciel de système de vidéo-tracking. </li><li> Prenez la souris par la queue et le placer dans l&#39;eau, avec sa tête dirigée vers le côté de la piscine, à partir de l&#39;une des quatre positions de départ (nord, sud, est, ouest). Pour chaque souris, la position de départ devrait être différent et pseudorandomized entre les essais. </li><li> Laissez le bain de la souris et de recherche pour le Platorm pour un maximum de 60 secondes. Une fois que l&#39;animal atteint la plate-forme, de lui permettre de rester sur la plate-forme pendant 20 sec. </li><li> Si la souris n&#39;a pas réussi à localiser la plate-forme au sein de ce moment-là, guider doucement la souris pour la plate-forme, en le tenant par la queue et laissez-le d&#39;y rester pendant 20 sec. Une fois que l&#39;animal a terminé toutes les deux essais, le sécher avec une serviette et le remettre en cage. </li><li> Chaque jour de la période de formation, répétez la même procédure (étapes 2.3.4-2.3.6). </li><li> Effectuer le test de la sonde au jour 9 après le dernier parcours de formation. </li><li> Retirer la plate-forme de la piscine. </li><li> Laissez le bain de la souris et de recherche pour la plate-forme pour un maximum de 60 secondes. </li><li> Périodiquement, vérifiez la température de l&#39;eau de sorte qu&#39;il devrait être la même (22 ° C) et nettoyer la piscine. </li></ol></li></ol> 3. Préparation des sections de perfusés Animaux <ol><li> Sacrifiez les souris à la fin de MWM. Quatre souris par génotype doivent être anesthésiés avant euthanization conformément aux directives locales et internationales. </li><li> Perfuser l&#39;animal transcardiaque (auriclewith droite intercepte une paire de ciseaux pour permettre un saignement et d&#39;introduire une canule de papillon dans le ventricule gauche à perfuser) avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 4-5 min, suivie de 4% de paraformaldehyde dans du PBS pendant 10 à 15 22 min. </li><li> Disséquer et post-fixer les cerveaux dans 4% de paraformaldehyde à 4 ° C pendant au moins 12 h. </li><li> Placez les cerveaux en tubes de 50 ml polystyrène coniques contenant 15 ml de 0,02% d&#39;azoture de sodium dans 0,1 M de PBS et conserver à 4 ° C jusqu&#39;au moment de trancher. </li><li> Couper et enlever le cervelet avant vibratome coupe. </li><li> Collez le cerveau droit avec le site de coupe, en utilisant la superglue, sur la plaque de support de la vibratome. </li><li> Couper le cerveau en 20-40 um coupes coronales épais, afin de série tout au long de l&#39;hippocampe dorsal, sur vibratome appropriée. </li><li> Recueillir vibratome tranches avec un pinceau et de transférer à un 24 plaque multi-puits contenant 1 ml de PBS 0,1 M à chaque puits. </li><li> sections de stockage pour court terme dans PBS ou à long terme dans les 0,02% d&#39;azoture de sodium dans du PBS à 4 ºC (tissus pourraient être utilisés pour un an au maximum). </li></ol> 4. immunohistochimie <ol><li> 5.3 Transfert des sections hippocampe dorsal pour chaque souris, 24 dans la plaque multi-puits contenant 500 pl de PBS 0,1 M à chaque puits. </li><li> Laver les sections contenues dans chaque puits avec 500 pi de PBS 0,1 M (5 min, 3 fois avec agitation douce). </li><li> Quench activité de peroxydase endogène, par incubation dans une des sections% de H 2 O 2 dans du PBS pendant 20 min sous agitation douce. </li><li> Laver les sections dans 0,1 M de PBS avec une agitation douce (3 x 5 min). </li><li> La perméabilisation de tissu: incuber les sections pendant 5 minutes dans 0,2% de Triton X-100 dans du PBS. </li><li> Au cours des étapes ci-dessus (4,4; 4,5), faire assez tampon de blocage (sérum de chèvre à 10% et 0,1% de Triton-X100 dans du PBS) pendant toute l&#39;expérience (number des sections x 100 pi x 3 marches). </li><li> Remarque: L&#39;utilisation de sérum de la même espèce, dans lequel le Ab secondaire (conjugué à la biotine) a été effectué. </li><li> Empêcher la liaison non spécifique de l&#39;anticorps, en faisant incuber les sections dans un tampon de blocage (100 ul / section) pendant 1 heure à la température ambiante (RT) sous agitation douce. </li><li> Incuber les coupes dans l&#39;enseignement primaire Ab (pERK) dilué dans du tampon de blocage, une nuit à 4 ° C, avec agitation douce. </li><li> Laver les sections dans 0,1 M de PBS avec une agitation douce (3 x 5 min). </li><li> Incuber avec l&#39;Ab secondaire conjugué avec de la biotine (1: 250) dilué dans du tampon de blocage (même que celui utilisé à l&#39;étape 4.6) pendant 1 heure à température ambiante avec agitation douce. </li><li> Préparer le réactif ABC en même temps, parce que Avidin et la biotine besoin d&#39;au moins 30 min à température ambiante au complexe. </li><li> Préparer le volume nécessaire de réactif ABC selon le protocole du fabricant. </li><li> Laver les sections dans 0,1 M de PBS avec une agitation douce (3 x 5 min). </li><li> Incubatsections e pendant 45 min à température ambiante avec ABC réactif. </li><li> Laver les sections dans 0,1 M de PBS avec une agitation douce (3 x 5 min). </li><li> Préparer DAB solution de travail, chaque étape impliquant DAB doit être fait dans la hotte que DAB est cancérigène et tératogène. </li><li> Transfert solution DAB à une nouvelle plaque à la pipette de transfert en plastique. </li><li> sections de place dans la plaque contenant DAB solution et la plaque lentement tourbillon de travail à la main, afin de permettre une exposition maximale aux sections. </li><li> Surveiller la réaction DAB sur microscope jusqu&#39;au signal adéquat développe (2-5 min). </li><li> Arrêter la réaction à l&#39;intensité de couleur désirée par lavage du tissu dans 0,1 M de PBS (3 x 5 min). </li><li> Utilisez l&#39;eau de Javel pour désactiver toute solution de substrat DAB restant dans la hotte pendant la nuit et en disposer selon les directives de laboratoire. </li><li> Sections de montage sur la gélatine revêtues diapositives en flottant dans PBS. Ensuite, séchez-les à température ambiante au moins 3-4 heures. </li><li> Déshydrater la sections séquentiellement dans 50%, 70%, 95%et de l&#39;éthanol à 100% pendant 2 min chacun, et clair dans 100% de xylène pendant 5 min. </li><li> Lamelle en utilisant un milieu de montage et laisser dans la hotte à sécher pendant la nuit. </li></ol> 5. comte cellulaire <ol><li> Compter les cellules positives pERK trois à cinq sections au niveau de l&#39;hippocampe dorsal doivent être analysées par animal. </li><li> Acquérir plusieurs images champ clair de chaque section au grossissement de 200x en utilisant un microscope approprié, puis de les assembler en utilisant un logiciel de traitement d&#39;image. </li><li> Effectuer la numération des cellules sur les images en mosaïque tiff converti en utilisant le logiciel gratuit ImageJ. </li><li> Compter les cellules pERK colorés dans la couche de cellules hile et le granule sur deux à trois boîtes de comptage de 100 × 100 um chacun. </li><li> Les densités cellulaires sont exprimés en nombre de cellules marquées par fenêtre de comptage (100 x 100 um). </li><li> Effectuer une analyse statistique pour évaluer différence significative entre les génotypes. Ceci peut être accompli avec t de Studentessai ou analyse de variance suivie par test post hoc appropriée en utilisant des logiciels commerciaux. Réglez le niveau de signification statistique à p &lt;0,05. </li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+the+learning+and+memory+deficits+associated+with+neurofibromatosis+type.">A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type.</a> I. Nature. 15, 281-284 (1997).</li><li>Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Place+navigation+impaired+in+rats+with+hippocampal+lesions.">Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions.</a> Nature. 297, 681-683 (1982).</li><li>Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+Most+Sensitive+Measure+of+Water+Maze+Probe+Test+Performance.">What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance.</a> Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4 (2009).</li><li>Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+gene+expression+in+the+rat+hippocampus+after+spatial+learning:+a+comparison+of+the+immediate-early+genes+Arc,+c-fos+and+zif268.">Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).</li></ol>

Les auteurs ont rien à communiquer

Ici, nous fournissons un protocole d&#39;immunohistochimie pERK pour révéler l&#39;activation neuronale suivante MWM en En2 souris - / -, un modèle de souris de troubles du développement neurologique. Diminution des niveaux de pERK ont été détectées dans le sous-champ CA3 de En2 - / - mutants par rapport à WT. A la différence de ce qui est observé dans le sous-champ CA3, une augmentation générale des neurones pERK-positifs a été détecté dans les deux à la place hile et GCL de En2 ...

Ces troubles neurologiques incluent un groupe de troubles tels que le syndrome de Down, le syndrome de l&#39;X fragile (FXS), le syndrome de Rett, la neurofibromatose, la sclérose tubéreuse et ASD, dans lequel le développement et la maturation du système nerveux central (SNC) est perturbé tôt au cours de large et hétérogène la période prénatale 1. Ces dysfonctionnements cérébraux développement peuvent causer profonds effets à long terme sur la fonction motrice, la langue, l&#39;apprentissage et le processus de la mémoire. Une pléthore de facteurs génétiques et environnementaux ont été impliqués dans la pathogenèse de troubles neurologiques du développement au cours des dernières années 2,3. Même si les mécanismes moléculaires sous-jacents le phénotype clinique demeurent inconnues, les résultats mentionnés ci-dessus ont permis le développement de plusieurs modèles de souris de ces troubles. les déficits de mémoire et d&#39;apprentissage ont été identifiés dans un certain nombre de ces modèles de souris tels que TSC1 +/-, TSC2 +/-,Nf1 +/- et En2 - / - souris 2,4-7. Un défi important dans le domaine des troubles du développement neurologique est l&#39;identification des processus cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la mémoire et le dysfonctionnement d&#39;apprentissage. Les voies de signalisation activées sélectionnés pendant l&#39;apprentissage ou de la mémoire peuvent induire la transcription de gènes spécifiques et finalement conduire à la synthèse de novo des protéines. Gènes précoces immédiats (IEG) activation et de protéines dépend modifications synaptiques sont induites rapidement dans les neurones du cerveau en réponse à l&#39;activité neuronale et la formation comportementale 8,9. Les déficits dans les voies de signalisation impliquant neurofibromine ont été associés à des troubles d&#39;apprentissage dans les troubles du développement neurologique. Neurofibromin est le produit du gène NF1, dont la mutation entraîne la neurofibromatose de type 1, un syndrome génétique complexe caractérisé par des tumeurs du système nerveux, des retards et du comportement moteur et cognitif disabilités 10. hétérozygote Souris pour Nf1 suppression restreinte aux neurones inhibiteurs présentent des déficits dans la phase précoce de la potentialisation à long terme (LTP), ainsi que l&#39;apprentissage spatial compromis dans MWM 5,11,12. Fait intéressant, la carence Nf1 dans ce modèle de souris conduit à une activation excessive de signalisation Ras dans les interneurones inhibiteurs au cours de l&#39;apprentissage, entraînant une augmentation de la phosphorylation de ERK et enfin à une amélioration de la libération de GABA anormale de ces neurones 5. Basé sur ces résultats, la visualisation de l&#39;activité neuronale après tâches comportementales représente un moyen de reconstruire circuits spécifiques impliqués dans les maladies neurologiques du développement. Le protocole d&#39;immunohistochimie décrit ici vise à évaluer et quantifier les niveaux de phosphorylation ERK hippocampe suivantes MWM dans un modèle de souris de TSA à des déficits cognitifs. MWM est largement utilisée pour étudier l&#39;hippocampe apprentissage spatial et la mémoire dépendante chez les rongeurs 13,14 </sjusqu&#39;à&gt;. Nous décidons d&#39;utiliser la phosphorylation de ERK comme lecture moléculaire de l&#39;apprentissage de l&#39;hippocampe tâche dépendante, puisque ERK a été démontré qu&#39;ils ont un rôle essentiel dans l&#39;apprentissage et la formation de la mémoire 15. En outre, la voie ERK est nécessaire pour l&#39;expérience de la plasticité du cortex visuel de développement 16. Enfin, les souris dépourvues de l&#39;une des deux isoformes ERK (ERK2) dans le spectacle CNS marqués anomalies dans les comportements cognitifs, émotionnels et sociaux 17, indiquant que la signalisation ERK pourrait jouer un rôle essentiel dans la pathogenèse de troubles neurodéveloppementaux tels que l&#39;ASD. Nous avons utilisé Engrailed 2 KO (En2 - / -) chez la souris comme modèle de troubles du développement neurologique. En2 - / - souris montrent des caractéristiques anatomiques et comportementales &quot;ASD-like&quot;, y compris la perte des interneurones du cerveau antérieur 18, réduction de l&#39;expression de gènes liés ASD-19, une diminution de la sociabilité et de la flexibilité cognitive altérée 6,7,20. Learni spatialeng et troubles de la mémoire, telles que celles détectées dans MWM, sont particulièrement robuste dans En2 - / - souris 6,7 et pourraient être pertinentes pour les troubles cognitifs observés chez les patients TSA 21. En outre, nous avons montré que l&#39;apprentissage spatial facultés affaiblies dans MWM est associée à l&#39;expression de neurofibromine réduite et l&#39;augmentation des niveaux Perk dans le hile En2 - / - souris adultes 7. Ici, nous présentons le protocole détaillé pour la caractérisation immunohistochimique de pERK suivante MWM dans ce modèle de souris de TSA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EthoVision XT 8</td>
			<td>Noldus Information Technology</td>
			<td></td>
			<td>This software platform is not a requirement &#8211; there are many other behavioral softwares on the market.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempera Paint</td>
			<td>Giotto - Fila Group Company</td>
			<td></td>
			<td>White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td>Equivalent models from other companies can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A406-20</td>
			<td>Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66004-950</td>
			<td>Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>G9023-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC kit Vectastain&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB peroxidase substrate</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td>4370</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1000&#160;</td>
			<td>Dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Slides&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>1879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>317616</td>
			<td>Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss&#160;</td>
			<td>Axio Imager.M2</td>
			<td>Equivalent microscope can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe Systems, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td>To assemble images.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot 11.0</td>
			<td>Systat Software Inc. (USA)</td>
			<td></td>
			<td>Equivalent softwares for statistical analysis can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 6</td>
			<td>GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td>Equivalent softwares for statistical analysis can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemical visualization of hippocampal neuron activity after spatial learning in a mouse model of neurodevelopmental disorders

Induction de la kinase extracellulaire régulée phosphorylée (pERK) est une lecture moléculaire fiable de l&#39;activation neuronale apprentissage dépendant. Ici, nous décrivons un protocole d&#39;immunohistochimie pERK d&#39;étudier le profil de l&#39;activation des neurones de l&#39;hippocampe après exposition à une tâche spatiale d&#39;apprentissage dans un modèle de souris caractérisé par des déficits cognitifs d&#39;origine neurologique du développement. Plus précisément, nous avons utilisé un marquage pERK pour étudier l&#39;activation neuronale suivante labyrinthe aquatique de Morris (MWM, une tâche d&#39;apprentissage de l&#39;hippocampe-dépendante classique) dans Engrailed-2 KO (En2 - / -) chez la souris, un modèle de troubles du spectre autistique (TSA). Par rapport à de type sauvage (WT) contrôles, En2 - / - souris ont montré d&#39;importants déficits d&#39;apprentissage spatial dans le MWM. Après MWM, des différences significatives dans le nombre de neurones pERK-positives ont été détectées dans les sous-champs spécifiques de l&#39;hippocampe En2 - / - souris, par comparaison aux animaux WT. Ainsi, notre protocole robuste peut détecter des différences danspERK neurones positifs associés à une altération de l&#39;apprentissage de l&#39;hippocampe-dépendante dans un modèle murin de la TSA. Plus généralement, notre protocole peut être appliqué à étudier le profil de l&#39;activation des neurones de l&#39;hippocampe dans les deux modèles génétiques souris ou pharmacologiques, caractérisé par des déficits cognitifs.

Le protocole décrit ici a été conçu pour visualiser, par immunohistochimie, l&#39;expression d&#39;un marqueur de l&#39;activité des neurones de l&#39;hippocampe après MWM spécifique dans un modèle de souris de troubles du développement neurologique. Toutes les données expérimentales présentées ici ont été prises à partir de notre récent travail 7. Mâle et femelle WT et En2 - / - littermates appariés pour l&#39;âge adulte (3-5 mois; poids = 25-35 g) obtenues à partir de croisem...

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Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Nous décrivons un protocole d&#39;immunohistochimie pour étudier le profil d&#39;activation des neurones de l&#39;hippocampe après exposition à une tâche spatiale d&#39;apprentissage dans un modèle de souris caractérisé par des déficits cognitifs d&#39;origine neurologique du développement. Ce protocole peut être appliqué sur les deux modèles génétiques souris ou pharmacologiques, caractérisée par des déficits cognitifs.

Visualisation immunohistochimique de l&#39;hippocampe Neuron Activité Après l&#39;apprentissage spatial dans un modèle de souris de troubles neurodéveloppementaux

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

immunohistochemical-visualization-hippocampal-neuron-activity-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K vues.  University of Trento.  Nous décrivons un protocole d'immunohistochimie pour étudier le profil d'activation des neurones de l'hippocampe après exposition à une tâche spatiale d'apprentissage dans un modèle de souris caractérisé par des déficits cognitifs d'origine neurologique du développement. Ce protocole peut être appliqué sur les deux modèles génétiques souris ou pharmacologiques, caractérisée par des déficits cognitifs. 

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Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) de fluorescence protéines marquées dans les épines dendritiques des neurones de l&#39;hippocampe de culture

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Recherche

Neurosciences

Using MazeSuite and Functional Near Infrared Spectroscopy to Study Learning in Spatial Navigation

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments1. MazeSuite can be used to design and edit adapted virtual 3D environments, track a participants' behavioral performance within the virtual environment and synchronize with external devices for physiological and neuroimaging measures, including electroencephalogram and eye tracking.
Functional near-infrared spectroscopy (fNIR) is an optical brain imaging technique that enables continuous, noninvasive, and portable monitoring of changes in cerebral blood oxygenation related to human brain functions2-7. Over the last decade fNIR is used to effectively monitor cognitive tasks such as attention, working memory and problem solving7-11. fNIR can be implemented in the form of a wearable and minimally intrusive device; it has the capacity to monitor brain activity in ecologically valid environments. 
Cognitive functions assessed through task performance involve patterns of brain activation of the prefrontal cortex (PFC) that vary from the initial novel task performance, after practice and during retention12. Using positron emission tomography (PET), Van Horn and colleagues found that regional cerebral blood flow was activated in the right frontal lobe during the encoding (i.e., initial na&iuml;ve performance) of spatial navigation of virtual mazes while there was little to no activation of the frontal regions after practice and during retention tests. Furthermore, the effects of contextual interference, a learning phenomenon related to organization of practice, are evident when individuals acquire multiple tasks under different practice schedules13,14. High contextual interference (random practice schedule) is created when the tasks to be learned are presented in a non-sequential, unpredictable order. Low contextual interference (blocked practice schedule) is created when the tasks to be learned are presented in a predictable order.
Our goal here is twofold: first to illustrate the experimental protocol design process and the use of MazeSuite, and second, to demonstrate the setup and deployment of the fNIR brain activity monitoring system using Cognitive Optical Brain Imaging (COBI) Studio software15. To illustrate our goals, a subsample from a study is reported to show the use of both MazeSuite and COBI Studio in a single experiment. The study involves the assessment of cognitive activity of the PFC during the acquisition and learning of computer maze tasks for blocked and random orders. Two right-handed adults (one male, one female) performed 315 acquisition, 30 retention and 20 transfer trials across four days. Design, implementation, data acquisition and analysis phases of the study were explained with the intention to provide a guideline for future studies.

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments. Functional near-infrared spectroscopy (fNIR) is an optical brain imaging technique that enables noninvasive and portable monitoring of cerebral blood oxygenation changes. This paper summarizes collective use of MazeSuite and fNIR within a cognitive processing learning paradigm.

Utiliser MazeSuite et fonctionnelle proche infrarouge pour étudier l&#39;apprentissage de la navigation spatiale

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments1. MazeSuite can be used to design and edit adapted ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance imaging. However, use of such methods in animal models requires anesthesia and hence both alters the brain state and prevents behavioral measures. An alternative method is the use of in vivo microdialysis to take continuous measurement of brain extracellular fluid concentrations of glucose, lactate, and related metabolites in awake, unrestrained animals. This technique is especially useful when combined with tasks designed to rely on specific brain regions and/or acute pharmacological manipulation; for example, hippocampal measurements during a spatial working memory task (spontaneous alternation) show a dip in extracellular glucose and rise in lactate that are suggestive of enhanced glycolysis1-3,4-5, and intrahippocampal insulin administration both improves memory and increases hippocampal glycolysis6. Substances such as insulin can be delivered to the hippocampus via the same microdialysis probe used to measure metabolites. The use of spontaneous alternation as a measure of hippocampal function is designed to avoid any confound from stressful motivators (e.g. footshock), restraint, or rewards (e.g. food), all of which can alter both task performance and metabolism; this task also provides a measure of motor activity that permits control for nonspecific effects of treatment. Combined, these methods permit direct measurement of the neurochemical and metabolic variables regulating behavior.

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Modulation of hippocampally-dependent spatial working memory by direct intrahippocampal microinjection, accompanied and followed by in vivo microdialysis for metabolites in conscious, behaving animals.

La micro-injection d&#39;insuline de l&#39;hippocampe et<em&gt; In vivo</emMicrodialyse&gt; Test de la mémoire spatiale cours

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and thus current therapeutic treatment strategies are not curative. Through the use of whole exome sequencing, an increasing number of genes have been identified to play a role in human locomotion. Despite identifying these genes, it is not known how these genes are crucial to normal locomotive functioning. Therefore, a reliable assay, which utilizes model organisms to elucidate the role of these genes in order to identify novel targets of therapeutic interest, is needed more than ever. We have designed a sensitized version of the negative geotaxis assay that allows for the detection of milder defects earlier and has the ability to evaluate these defects over time. The assay is performed in a glass graduated cylinder, which is sealed with a wax barrier film. By increasing the threshold distance to be climbed to 17.5 cm and increasing the experiment duration to 2 min&#160;we have observed a greater sensitivity in detecting mild mobility dysfunctions. The assay is cost effective and does not require extensive training to obtain highly reproducible results. This makes it an excellent technique for screening candidate drugs in Drosophila mutants with locomotion defects.

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

Analyse quantitative des défauts d&#39;escalade dans un modèle drosophile de maladies neurodégénératives

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies indicate that the severity of brain injury appear to be sex dependent, and that the male neonates are more susceptible to the effects of HI-related brain injury, resulting in more severe neurological outcomes as compared to females with comparable brain injuries. The development of reliable methods to isolate and maintain highly enriched populations of sexed hippocampal astrocytes is essential to understand the cellular basis of sex differences in the pathological consequences of neonatal HI. In this study, we describe a method for creating sex specific hippocampal astrocyte cultures that are subjected to a model of in-vitro ischemia, oxygen-glucose deprivation, followed by reoxygenation. Subsequent reactive astrogliosis was examined by immunostaining for the Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and S100B. This method provides a useful tool to study the role of male and female hippocampal astrocytes following neonatal HI, separately.

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrocytes are one of the most important key players in the central nervous system (CNS). Here, we are reporting a practical method of sexed hippocampal astrocyte culture protocol in order to study the mechanisms underlying the astrocyte function in male and female neonate pups after in-vitro ischemia.

Différences entre les sexes dans la souris hippocampiques astrocytes après<em&gt; In-Vitro</em&gt; ischémie

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

Résolution quantitative Haute Synaptic Proteome Profiling des souris régions cérébrales Après Auditory Discrimination apprentissage

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Faible densité primaire hippocampique Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Assessing Spatial Learning and Memory in Small Squamate Reptiles

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, interest in the cognitive processes of nonmodel species, typically within an ecological context, has also become an emerging field of study. In particular, interest in the cognitive processes in reptiles is growing although experimental studies on reptilian cognition are sparse. The few reptilian studies that have experimentally tested for spatial learning and memory have used rodent paradigms modified for use in reptiles. However, ecologically important aspects of the physiology and behavior of this taxonomic group must be taken into account when testing for spatially based cognition. Here, we describe modifications of the dry land Barnes maze and associated testing protocol that can improve performance when probing for spatial learning and memory ability in small squamate reptiles. The described paradigm and procedures were successfully used with male side-blotched lizards (Uta stansburiana), demonstrating that spatial learning and memory can be assessed in this taxonomic group with an ecologically relevant apparatus and protocol.

This paper describes a modification of the Barnes maze, a standard rodent paradigm used to assess spatial memory and learning, for use in small squamate reptiles.

Évaluation de l&#39;apprentissage spatial et la mémoire dans les petits squamate Reptiles

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

L’utilisation de Trace Eyeblink conditionnement de classique pour évaluer le dysfonctionnement hippocampique dans un modèle de Rat de Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.