En étiquetant génétiquement les cellules individuelles avec des protéines fluorescentes et en suivant ces cellules au fil du temps, la souris confettis a permis aux chercheurs de révéler de nouvelles perspectives sur de nombreux processus biologiques. Notre protocole minimise le délai entre la collecte des tissus et l’imagerie, peut être appliqué à n’importe quel tissu minéralisé ou non minéralisé et préserve la fluorescence pendant plusieurs années. Cette méthode est très utile pour tous les domaines de la médecine régénérative et de la biologie du développement, car elle peut être appliquée à différentes populations cellulaires pour étudier leur sort et leur cinétique tant qu’une ligne Cre appropriée est disponible.
Nos instructions étape par étape démontreront l’étape la plus difficile pour distinguer la différence de signaux fluorescents émis par différentes protéines fluorescentes. Commencez par préparer le tissu de la souris à l’imagerie. Pour les tissus mous et le tibia minéralisé et le femora de souris jusqu’à l’âge de 45 jours, fixez le tissu dans le PBS précooled de formaldéhyde de 3,7% et l’incuber à 4 degrés Celsius pendant six heures tout en roulant doucement sur un rotateur.
Pour les tissus minéralisés tels que le tibia et le femora de souris âgées de plus de 45 jours, préparer un litre de solution 10%EDTA avec le pH ajusté à 8,05 avec hydroxyde de sodium et diluer le formaldéhyde à 3,7% en utilisant cette solution. Fixez le tissu en le maintenant dans 3,7% de formaldéhyde PBS pendant la nuit à 4 degrés Celsius. Le lendemain, placez-le dans la solution précoolée de formaldéhyde EDTA et incubez-le à 4 degrés Celsius tout en tournant pendant 48 heures, en s’assurant de remplacer la solution trois fois pendant l’incubation.
Ensuite, placez le tissu dans précooled 30% saccharose, en s’assurant de remplir le récipient à ras bord, et doucement le faire pivoter pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le matin, utilisez des forceps pour enlever le tissu de la solution de saccharose et rincez-le en cinq millilitres de composé optimal de température de coupe, ou OCT, pendant quelques secondes. Remplissez un cryomold pré-étiqueté avec oct et placez le tissu au fond, en travaillant rapidement pour éviter que l’échantillon soit assis à température ambiante pendant trop longtemps.
Intégrer l’échantillon en plaçant le moule sur de la glace sèche et en attendant que l’OCT se solidifie. Si les échantillons ne sont pas utilisés immédiatement, ils peuvent être conservés à moins 20 degrés Celsius. Retirer le bloc du moule.
Appliquer l’OCT entre le haut du bloc et le mandrin et le refroidir dans le cryostat pendant au moins cinq minutes ou jusqu’à ce que l’OCT se solidifie complètement. Précoolez le porte-échantillon et le porte-lames à moins 20 degrés Celsius, puis placez l’échantillon dans le porte-mandrin et la lame dans le porte-lame, et laissez-les équilibrer pendant plusieurs minutes. Pour l’analyse postnatale des plaques de croissance, préparez des sections de 30 à 160 micromètres.
Utilisez le cryostat pour couper le bloc et couper les sections de tissu à une épaisseur appropriée et les recueillir sur des toboggans. Ensuite, séchez les glissières à température ambiante jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches et conservez-les à moins 20 degrés Celsius jusqu’à 36 mois. Lorsque vous êtes prêt à utiliser la lame, retirez-la du congélateur et apportez-la à température ambiante dans un porte-glissière.
Pour enlever l’OCT, appliquez doucement le PBS sur la lame avec la pipette Pasteur. Pour 160 sections micromètres d’épaisseur, incuber la lame pendant 15 minutes, retirer le liquide et appliquer du PBS frais pendant cinq minutes de plus. Montez les glissières dans une solution de 75% de thiodiéthanol à température ambiante avec des glissements de couverture de 60 millimètres de long.
Tout d’abord, sélectionnez le canal DP en cliquant dessus dans l’onglet canaux, ce qui provoque l’affichage des détails du canal dans l’onglet chemin lumineux. Cliquez ensuite sur la case à cocher à côté de T-PMT. Placez la glissière dans le support de la glissière et placez le tissu d’intérêt directement entre le chemin lumineux et la lentille objective.
Pour localiser le tissu, désélectionner les boîtes YFP et CFP sous le cap des voies de l’onglet canaux. Sélectionnez le canal T-PMT dans le titre des pistes, puis cliquez en direct dans l’onglet acquisition et augmentez le gain pour le canal T-PMT afin de visualiser la sélection des tissus à l’écran. Ajustez la position de la glissière pour localiser la région d’intérêt et concentrez-vous à l’aide du bouton microscope approprié.
Cliquez ensuite sur arrêter dans l’onglet d’acquisition pour désactiver l’exposition au laser. Définissez les paramètres d’imagerie en fonction des instructions manuscrites et ajustez la taille du sténopé si nécessaire. Vérifiez la configuration pour vous assurer que les signaux enregistrés ne se chevauchent pas, puis sélectionnez les trois canaux dans l’onglet canaux et appuyez sur le bouton snap.
Faites défiler entre les canaux d’affichage de l’image résultante en cliquant sur les cases bleues surlignées au-dessus de chaque canal dans l’onglet dimensions et vérifiez manuellement le chevauchement entre les canaux de l’écran. Si les signaux se chevauchent, réajuster les paramètres jusqu’à ce qu’ils puissent être distingués les uns des autres. Ce protocole a été utilisé pour étiqueter les chondrocytes dans le cartilage épiphyséal et visualiser leur expansion clonale avec l’âge.
La section centrale a été déterminée en visualisant le ligament cruciforme et des clones dans la plaque tibiale proximale de croissance ont été imaged. Les cellules individuelles qui étaient positives col2 et sont devenues étiquetées avec des protéines fluorescentes confetti sur l’administration de tamoxifène, ont subi l’expansion clonale et sont plus tard restées dans la plaque de croissance. Le signal fluorescent peut être visualisé après stockage à long terme.
Certaines sections ont été entreposées pendant plus de trois ans avant la préparation et l’imagerie. La reconstruction tridimensionnelle a été effectuée automatiquement avec un logiciel d’analyse d’image et exportée sous forme de vidéo. Une section cassée pendant l’étape de cryosection contient une zone avec un tel niveau élevé de recombinaison qu’elle empêcherait l’analyse clonale, démontrant un des problèmes communs rencontrés avec ce protocole.
Selon votre question de recherche, l’utilisation d’une ligne Cre qui labelsait spécifiquement vos cellules d’intérêt pourrait être très importante. Par conséquent, nous recommandons de vérifier la fluorescence dans ces cellules peu de temps après la recombinaison. L’utilisation de lignes cre inductibles est essentielle parce que la recombinaison continue de l’ADN dans les lignées cre non inductibles peut modifier le profil fluorescent des cellules solutées, empêchant ainsi l’analyse clonale.
Ce protocole peut être combiné avec des perturbations fonctionnelles telles que des souches génétiquement manipulées, des traitements pharmacologiques, des interventions chirurgicales, ainsi que la coloration immuno fluorescence des sections préparées.
