Biz tartışma için Mathias S. Dick, Roland F. Dreier ve Sebastian Ruhl kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, bir SNSF Profesörlük PP00P3_139120 / 1 ve PB Bir Üniversite Basel proje hibe ID2153162 tarafından desteklenmiştir

Salmonella MCherry-ifade ile 1. Digitonin Deneyi (Analiz FACS tabanlı) <ol><li> Hazırlama bakteriler Not: bir plazmid (pFPV rpsM destekleyicisi altında mCherry kodlayan) için mCherry eksprese Salmonella, vahşi tip SL1344 (Streptomisin dirençli) bu deneyde kullanılır. MCherry konstitütif ekspresyonu ile değişmediğini Bakteriyel fagositoz ve proliferasyon 16 (veriler gösterilmemiştir). <ol><li> 37 ° CO / N bir çalkalayıcıda streptomisin (90 ug / ml) ve ampisilin (100 ug / ml, MCherry ifade vektörü) ile desteklenmiş LB aracı maddesi içinde 3 ml enfeksiyondan önce soyu 1 gün inoküle. </li></ol></li><li> Enfeksiyon hücreleri Kaplama. <ol><li> 1.25 x 10 5 hücre yoğunluğunda 24 oyuklu bir plaka içerisinde tohum vahşi tip BMDMs / göz birincil makrofaj ortamı, 1 ml (DMEM,% 10 fetal buzağı serumu (FCS, ısı ile inaktive edilmiş, 56 ° C&#39;de, 30 dakika ile desteklenmiş ),% 1 HEPES,% 1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA),% 1 L-glutamin ve% 10 L929 süpernatan (makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF şartlanmış ortam) L929 hücrelerini üreten). Tablo 1&#39;e göre Tohum kuyuları tek tek koşullara hesaba. Kontrol (Tablo 1) olarak kullanılan oyuklara lamelleri ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de bir inkübatör içinde gece boyunca inkübe hücreleri ve% 5 CO2. </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Permeabilizasyon </td><td colspan="3"> Boyanma </td></tr><tr><td></td><td> Cam lamel </td><td> Salmonella </td><td> Digitonin </td><td> Saponin </td><td> anti-Salmonella </td><td> Anti-calnexin </td><td> Anti-PDI </td></tr><tr><td> A1 (örnek) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A2 (örnek) </td><td> - / + * </td><td> + </td&gt; <td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A3 (örnek) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A4 (hayır permeabilization kontrol) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A5 (tam permeabilization kontrol) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> B1 (calnexin lekeli) </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B2 (calnexin lekeli) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B3 (calnexin lekeli) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> C1 (lekeli) PDI için </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C2 (PDI için lekeli) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C3 (PDI için lekeli) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Salmonella, geçirgenliği ve boyama daha sonra, enfeksiyon için 24 oyuklu bir formatta, kemik iliği türevli makrofajlar (BMDMs) için kaplama şeması * Protokol 1 ya da protokol 2 yapılır olup olmamasına bağlı olarak değişir.. <ol start="3"><li> Enfeksiyonu bakteriyi hazırlanması. <ol><li> Sonraki gün, PBS içinde kültür 1:10 seyreltilmesiyle ve yalnızca PBS kontrolüne karşı OD 600 ölçülerek, gece boyunca kültürdeki Salmonella konsantrasyonunu belirler. Bu OD 600 l ölçülür sağlarspektrofotometrenin inear aralığı. </li><li> Ml başına Salmonella konsantrasyonu hesaplanır. 1 OD600 1 x 10 9 bakteri karşılık gelir. </li><li> 1.25 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyona ulaşmak için Salmonella makrofaj ortam içinde bakteri ile seyreltilir. </li></ol></li><li> Salmonella ile hücrelerin enfeksiyonu. <ol><li> BMDMs orta çıkarın. Enfekte edilmemiş kontrol çukurları (B1-B3, C1-C3) makrofaj ortamın 1 ml ilave edilir. Kuyu A1 Salmonella süspansiyonu 1 ml ilave edilir - A5, hücre başına 10 bakteri enfeksiyonu (moi) &#39;in bir çokluğu ulaşmak için. </li><li> Enfeksiyonu senkronize etmek için 37 ° C&#39;de 300 x g&#39;de 15 dakika boyunca plaka santrifüjleyin. 37 ° C&#39;de bir inkübatörde plaka aktarın ve% 5 CO2. </li></ol></li><li> Gentamisin ile hücre dışı Salmonella Killing. <ol><li> 1 saat sonrası enfeksiyon, inkübatör plaka kaldırmak ve 0.1 mg / ml gentamisin ihtiva eden makrofaj ortamın 0.1 ml ilaveekstrasellüler bakterileri öldürmek için. Tüm hücreler aynı şekilde muamele olmasını sağlamak için, daha da enfekte olmamış kontrollere göre, tüm oyuklara gentamisin ekleyin. 37 ° C&#39;de bir inkübatörde plaka aktarın ve% 5 CO2. </li></ol></li><li> Hücreleri Yıkama. <ol><li> 2 saat sonra enfeksiyondan, inkübatör plaka kaldırmak ve kuyular düz DMEM 1 ml 2x yıkama (önceden ısıtılmış 37 ° C) ve makrofaj ortam ile yerine 10 ug / ml içeren (37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış) &#160; Gentamisin kalan dışı bakterilerin gelişimini önlemek için. 37 ° C&#39;de bir inkübatörde plaka aktarın ve% 5 CO2. </li></ol></li><li> Deterjan ve antikorlar ile taze tamponlar hazırlanması. <ol><li> Sadece analiz istenilen zaman noktasından önce, 1 mg / KHM Tamponu içinde ml (110 mM potasyum asetat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.3) ile digitonin taze bir stok çözelti hazırlayın. Bir çalışma konsantrasyonu tampon stok Filtre ve KHM sulandırmakdigitonin 50 ug / ml. Buna ek olarak, KHM Tamponu, KHM içinde 1/100 1/100 ya da anti-PDI ile 1/500 anti-calnexin de FITC (CSA-1-FITC) bağlı anti-Salmonella antikorda% 0.1 saponin içeren bir çözelti hazırlanması Tampon% 3 BSA ile takviye edilmiştir. </li></ol></li><li> Hücre permeabilizasyon. <ol><li> Inkübatörden plaka çıkarın ve yıkama kuyu KHM Tamponu, 0.5 ml (37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış) 3x. A3 ve kuyular A5 ve B3 saponin ile B2 / C2 veya KHM Tampon / C3 (Tablo 1&#39;e göre) - KHM Buffer çıkarın ve kuyu A1 digitonin kuyu A4 ve B1 / C1, KHM Tampon 0.25 ml düz KHM Tampon ekleyin. Tüm oyuklar KHM Tamponu, 0.5 ml ile 3 kez yıkama hemen oda sıcaklığında tam olarak 1 dakika boyunca inkübe ve (37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış). </li></ol></li><li> Birincil antikor boyama. <ol><li> Uygun oyuklara primer antikor çözeltileri (keçi anti-Salmonella -FITC, 250 ul / göz, 0.1 ug / ml) KHM tamponunu çıkarın ve ekleme (Şekil 1 </strong&gt;, Tablo 1). 37 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde, 15 dakika boyunca plaka inkübe ve% 5 CO2. </li><li> 1 ml PBS ile 1x hücreleri yıkayın. </li></ol></li><li> Enfekte edilen hücreler, (kuyular A1 - A5): FACS analizi <ol><li> Yıkama hücreler PBS ile 3 kez yıkandı ve% 0.1 Triton içeren buz soğukluğunda PBS, 0.5 ml. Hücre agrega kırmak için hücre süzgecinden kapağı ile 5 ml FACS tüp aktarın. Buz üzerinde örnekleri tutun. </li><li> Bir FACS örnekleri analiz edin. Tam geçirgen denetimleri kullanarak, toplam ileriye dayalı bakteri ve birinci yan dağılım (FSC / SSC) için kapısı ayarlayın ve mCherry sinyali (610 nm ± 20 nm filtre). </li><li> Sonraki, sitozolik bakteriler için kapıları (FITC + mCherry +) ve vakuolar bakterileri (FITC-, mCherry +) (Şekil 3) ayarlamak için tam geçirgen ve geçirgen olmayan kontrollerini kullanarak toplam bakteri popülasyonunda FITC sinyali analiz. </li><li> Kapıları set sayesinde, örnekleri analiz ve sitozolik vs yüzdesini belirlemeküreticinin protokolüne uygun olarak FlowJo yazılımı kullanılarak vakuolar bakteri. </li></ol></li><li> Bulaşmamış permeabilization denetimleri (kuyular B1 - B3, C1 - C3): mikroskopi <ol><li> Tespit <ol><li> PBS çıkarın ve PBS içinde% 4 PFA 250 ul ekleyin. 37 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Kuyular PBS içinde 1 ml 2x yıkayıp fiksatif sönmesi için 10 dakika boyunca PBS içinde 0.1 M glisin 250 ul ilave edin. Yıkama kuyu 1 ml PBS ile 2x. </li></ol></li><li> İkincil antikor boyama. <ol><li> PBS içinde florofor bağlanmış uygun bir ikincil antikor ile oda sıcaklığında 1 saat için leke permeabilizasyon kontrol,% 0.1 saponin ve% 3 BSA tam Permeabilize hücreleri ile takviye edilmiştir. </li><li> Yıkama 1 ml PBS ile 3 kez lamelleri ve DAPI (1.5 ug / ml) ile orta montaj analiz için lamelleri monte edin. </li></ol></li><li> Mikroskopi analizi. <ol><li> Konfokal FLUO kullanarak 40X veya 63X büyütmede kontroller ile lamelleri analizrescence mikroskop. Permeabilizasyon çalıştığı takdirde, digitonin- ve saponin permeabilize hücrelerin ve PDI saponin permeabilize hücrelerin (Şekil 4) yalnızca boyanma için olmayan permeabilize hücreler için boyama, boyama calnexin olmalıdır. </li></ol></li></ol></li></ol> Etiketsiz Salmonella (Mikroskopi tabanlı Analizi) 2. Digitonin Deneyi <ol><li> O / N kültürler için bakteri hazırlanması. <ol><li> Etiketlenmemiş Salmonella, vahşi tip SL1344 inoküle (Streptomisin dirençli) 37 ° CO / N bir çalkalayıcıda streptomisin (90 ug / ml) ile desteklenmiş LB aracı maddesi içinde 3 ml enfeksiyondan önce 1 gün. </li><li> Enfeksiyon hücreleri Kaplama. <ol><li> 1.25 x 10 5 hücre yoğunluğunda steril cam lamelleri içeren bir 24 oyuklu bir plaka içerisinde tohum BMDMs / oyuk makrofaj ortam 1 ​​ml (DMEM,% 10 fetal buzağı serumu (FCS ile de-tamamlanmaktadır, 56 ° C ilave olarak,30 dakika),% 1 HEPES,% 1 L-olmayan amino asitleri (NEAA),% 1 L-glutamin ve% 10 L929 süpernatant). Tablo 1&#39;e göre Tohum kuyuları tek tek koşullara hesaba. </li><li> 37 ° C&#39;de bir kuluçka hücreleri O / N inkübe ve% 5 CO2. </li></ol></li><li> Enfeksiyonu bakteriyi hazırlanması. <ol><li> Sonraki gün, PBS içinde kültür 1:10 seyreltilmesiyle ve yalnızca PBS kontrolüne karşı OD 600 ölçülerek O / N kültüründe Salmonella konsantrasyonunu belirler. Bu OD 600 spektrofotometre doğrusal aralığı içinde ölçülür sağlar. </li><li> Mililitrede Salmonella konsantrasyonunu belirlemek. 1 bir OD 600, 1 x 10 9 bakteri karşılık gelir. </li><li> 1.25 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyona ulaşmak için Salmonella makrofaj ortam içinde bakteri ile seyreltilir. </li></ol></li><li> Salmonella ile hücrelerin enfeksiyonu. <ol&gt; <li> Tüm kuyulardan orta çıkarın. Enfekte edilmemiş kontrol çukurları düz makrofaj ortamın 1 ml ilave edilir (B1 - B3, C1 - C3 alkil). Kuyu A1 Salmonella süspansiyonu 1 ml ilave edilir - A5, hücre başına 10 bakteri enfeksiyonu (moi) &#39;in bir çokluğu ulaşmak için. </li><li> Enfeksiyonu senkronize etmek için 37 ° C&#39;de 300 x g&#39;de 15 dakika boyunca plaka santrifüjleyin. 37 ° C&#39;de bir inkübatörde plaka aktarın ve% 5 CO2. </li></ol></li><li> Gentamycin ile hücre dışı Salmonella Killing. <ol><li> 1 saat sonrası enfeksiyon, inkübatör plaka kaldırmak ve tüm oyuklara hücre dışı bakterileri öldürmek için, 1 mg / ml gentamisin ihtiva eden makrofaj ortamın 0.1 ml ekleyin. 37 ° C&#39;de bir inkübatörde plaka aktarın ve% 5 CO2. </li></ol></li><li> Hücreleri Yıkama. <ol><li> 2 saat sonrası enfeksiyon, inkübatör plaka kaldırmak ve 10 ug / ml içeren taze makrofaj ortam 1 ml her bir kuyucuğa 3x yıkama Önlemek için gentamisinKalan dışı bakterilerin büyümesi. 37 ° C&#39;de bir inkübatörde plaka aktarın ve% 5 CO2. </li></ol></li><li> Deterjan ve antikorlar ile taze tamponlar hazırlanması. <ol><li> Sadece analiz istenilen zaman noktasından önce, 1 mg / KHM Tamponu içinde ml (110 mM potasyum asetat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.3) ile digitonin taze bir stok çözelti hazırlayın. Stok filtre edin ve 50 ug / ml &#39;lik bir çalışma konsantrasyonu KHM Tamponu içinde seyreltin digitonin evi. </li><li> Buna ek olarak, KHM Tamponu içinde% 0.1 saponin içeren bir çözelti hazırlanması, anti-Salmonella -FITC (CSA-1, 0.1 ug / ml), KHM Tamponu içinde 1/100 1/100 ya da anti-PDI anti-calnexin ile desteklenmiş % 3 BSA (antikor konsantrasyonu için malzeme tabloya bakınız). </li></ol></li><li> Hücre permeabilizasyon. <ol><li> Inkübatörden plaka çıkarın ve yıkama kuyu KHM Tamponu, 0.5 ml (37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış) 3x. KHM Buffer çıkarın ve 0.25 ml düz KHM Tampon ekleyinkuyu A1 digitonin kuyu A4 ve B1 / C1, KHM Tampon için - A3 ve B2 / saponin ile C2 veya KHM Tampon kuyu A5 ve B3 / C3 (Tablo 1&#39;e göre). Tüm oyuklar KHM Tamponu, 0.5 ml ile 3 kez yıkama hemen oda sıcaklığında tam olarak 1 dakika boyunca inkübe ve (37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış). </li></ol></li><li> Birincil antikor boyama. <ol><li> KHM tamponunu çıkarın ve uygun kuyulara (Şekil 2, Tablo 1), birincil antikor çözeltileri (keçi anti Salmonella CSA1-FITC, 250 ul / göz, 0.1 ug / ml) ekleyin. 37 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde, 15 dakika boyunca plaka inkübe ve% 5 CO2. 1 ml PBS ile yıkayın 3x. </li></ol></li><li> Fixation. <ol><li> PBS çıkarın ve PBS içinde% 4 PFA 250 ul ekleyin. 37 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Kuyular PBS içinde 1 ml 2x yıkayıp fiksatif sönmesi için 10 dakika boyunca PBS içinde 0.1 M glisin 250 ul ilave edin. Yıkama kuyu 1 ml PBS ile 2x. </li></ol></li><li> ToplamEnfekte örneklerin Salmonella boyama. <ol><li> Yıkama,% 0.1 saponin /% 3 BSA içeren PBS ile 3 kez lamelleri ve bir anti-CSA1 antikoru ile inkübe örnekleri 1 saat süre ile (keçi anti-CSA1, 0.1 ug / ml fare anti-LPS, 0.1 ug / ml olarak iyi çalışır) % 0.1 saponin /% 3 BSA ile PBS içinde oda sıcaklığında karıştırıldı. </li><li> % 0.1 saponin /% 3 BSA ile PBS içinde yıkayın 3x. Karanlıkta, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 0.1 saponin /% 3 BSA ile PBS içinde tercih edilen flüorofora bağlı ikinci bir anti-keçi antikoru ile inkübe edin. </li><li> Yıkama 1 ml PBS ile 3 kez lamelleri ve DAPI (1.5 ug / ml) ile orta montaj analiz için lamelleri monte edin. </li></ol></li><li> Mikroskopi analizi. <ol><li> Sitozolik Salmonella (pozitif anti Salmonella -FITC) ve total Salmonella (çift pozitif) (Şekil 5) sayarak bir konfokal mikroskop ile veri elde. Permeabilizasyon kontrolleri göstermelidir: non-permeabilize hücrelerin, calnexin s hiçbir boyamaDigitonin permeabilize hücrelerin ve saponin permeabilize hücrelerin için PDI, boyama için taining (Şekil 4). Wells A4 ve A5 Salmonella boyama için iç denetimler görev yapacak. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kumar, Y., Valdivia, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leading+a+sheltered+life:+intracellular+pathogens+and+maintenance+of+vacuolar+compartments.">Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments.</a> Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).</li><li>Chong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+phagosomal+stage+of+Francisella+tularensis+determines+optimal+phagosomal+escape+and+Francisella+pathogenicity+island+protein+expression.">The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression.</a> Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).</li><li>Mellouk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+subverts+the+host+recycling+compartment+to+rupture+its+vacuole.">Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole.</a> Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).</li><li>Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy-mediated+reentry+of+Francisella+tularensis+into+the+endocytic+compartment+after+cytoplasmic+replication.">Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).</li><li>Broz, P., Monack, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+described+pattern+recognition+receptors+team+up+against+intracellular+pathogens.">Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens.</a> Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).</li><li>Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+LPS+activates+caspase-11:+implications+in+TLR4-independent+endotoxic+shock.">Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock.</a> Science. 341, 1250-1253 (2013).</li><li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+of+intracellular+Shigella+from+autophagy.">Escape of intracellular Shigella from autophagy.</a> Science. 307, 727-731 (2005).</li><li>Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonellae+interplay+with+host+cells.">Salmonellae interplay with host cells.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).</li><li>Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+controls+Salmonella+infection+in+response+to+damage+to+the+Salmonella-containing+vacuole.">Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole.</a> J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).</li><li>Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bimodal+lifestyle+of+intracellular+Salmonella+in+epithelial+cells:+replication+in+the+cytosol+obscures+defects+in+vacuolar+replication.">The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication.</a> PLoS One. 7, e38732 (2012).</li><li>Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+Toxoplasma+gondii+parasitophorous+vacuole+by+IFNgamma-inducible+immunity-related+GTPases+(IRG+proteins)+triggers+necrotic+cell+death.">Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death.</a> PLoS Pathog. 5, e1000288 (2009).</li><li>Meunier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-11+activation+requires+lysis+of+pathogen-containing+vacuoles+by+IFN-induced+GTPases.">Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases.</a> Nature. 509, 366-370 (2014).</li><li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cluster+of+interferon-gamma-inducible+p65+GTPases+plays+a+critical+role+in+host+defense+against+Toxoplasma+gondii.">A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii.</a> Immunity. 37, 302-313 (2012).</li><li>Degrandi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+guanylate+binding+protein+2+(mGBP2)+controls+Toxoplasma+gondii+replication.">Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).</li><li>Mariathasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activation+of+the+inflammasome+by+caspase-1+adaptors+ASC+and+Ipaf.">Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf.</a> Nature. 430, 213-218 (2004).</li><li>Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+cytosolic+Salmonella+in+epithelial+cells.">Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells.</a> PLoS One. 9, e84681 (2014).</li><li>Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+flow+cytometry+to+determine+differential+redistribution+of+cytochrome+c+and+Smac/DIABLO+from+mitochondria+during+cell+death+signaling.">Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling.</a> PLoS One. 7, e42298 (2012).</li><li>Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+orientation+of+the+human+papillomavirus+type+16+E5+oncoprotein.">Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein.</a> J Virol. 84, 1696-1703 (2010).</li><li>Keller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+measurements+of+vacuolar+rupture+caused+by+intracellular+pathogens.">Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens.</a> J Vis Exp. , e50116 (2013).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Diferansiyel permeabilization analiz ve vakuolar bölmeleri ve sitoplazmada arasındaki bakteriyel patojenlerin hücre içi dağıtım ölçmek için kolay ve sağlam bir yöntemdir. Aynı deney gibi Francisella novicida 2,4 ve Shigella flexneri 12 olarak bakteri başarıyla kullanılmaktadır. Birçok hücre içi patojen değiştirebilir veya ana bilgisayar hücreiçi yapılarını değiştirmek olduğundan Ancak, digitonin permeabilization sağlamlığı bireysel olarak belirlen...

Hücre içi bakteriyel patojenler doğrudan konak hücre sitoplazmada veya uzman vakuoler bölmelerde 1 ya çoğaltmak. Enfeksiyonun başlangıç ​​aşamasında en patojenler (örneğin histiositler gibi) ya da aktif bir fagositik olmayan hücrelere kendi alımını teşvik ederek özel hücreler tarafından fagositoz yoluyla internalize olsun. Fagositik hücrelerde, fagosom normalde fagosite parçacıklar sindirilir bir parçalayıcı bölme oluşturmak için lizozomlar ile sigortalar. Böyle Francisella novicida veya Shigella flexneri gibi özel sitozolik bakteriler, fagozomun rüptürü uyararak phagosomal bozulmasını kaçmak ve daha sonra sitozol 2,3 kaçmasına. Bu tür vakuoler rüptürü 2-4 teşvik efektör proteinleri enjekte Francisella Patojenite Adası (FPI) ya da Shigella flexneri T3SS gibi virülans ilişkili mekanizması gerektirir. konakçı hücre sitosol özellikleriNormalde patojenlerin varlığı tanımak ve 5 sinyal doğuştan gelen bağışıklık neden korunmuş örüntü tanıma reseptörleri bir dizi. Buna ek olarak, xenophagy, otofaji bir anti-mikrobiyal formu sitoplazmada girmek bakteri düşürebilir. Sitozolik bakteriler normalde iyi künt veya farklı stratejiler kullanarak bu yanıtları aşmak için uyarlanmıştır. Örneğin, Francisella konak tanıma önlemek için kendi LPS değiştirir ve Shigella salgılanan proteinler efektör 6,7 kullanarak otofaji işe engeller. Lizozomal bozulması kaçmak için bir başka strateji modeli vaküoler patojen Salmonella serovar Typhimurium&#39;da tarafından istihdam edilmektedir, bundan sonra Salmonella typhimurium olarak anılacaktır. Salmonella hücre içi niş içine ilk phagosome pişmanlık efektörleri enjekte etmek için bir T3SS kullanır Salmonella vakuol (SCV) içeren 8,9. Ev sahibi yollarının sürekli manipülasyon olduğunuGerekli vaküole lipidler ve diğer besin alımı yoluyla bu çarpıtma korumak için. Gerçekten de, Salmonella şifa mutant vakuolar stabilitesini korumak için başarısız olur ve doğuştan gelen bağışıklık yolları ve Otofaji işe 8 aktivasyonu ile sonuçlanır enfeksiyondan sonra birkaç saat içinde konakçı hücrelerin sitosol girer. Salmonella koful çıkış çalışmaları olduğu hücre tipine bağlı olarak değişir, ve çeşitli epitelial hücrelerinde daha WT Salmonella sitozol 10 SCV ve hyperreplicate kaçabilir göstermiştir. Son raporlar vakuoler patojenlerin doğuştan gelen bağışıklık tespiti de tanımak ve patojen içeren vakuoller (PCVS) 11-14 istikrarsızlaştırmak için konağın yeteneğine bağlıdır göstermektedir. Ev sahibi ya da bakteri hem genotip vaküoler ve sitozolik bölme arasındaki hücre içi bakteri dağılımını etkileyebilir göz önüne alındığında, bu vaküoler vs sayısını ölçmek için gerekli olansitosolik bakteri. Bu yana, en deney düzeneğinde konakçı hücreler, farklı hücre içi bölmelerde bir çok bakteri barındırabilir, daha sonra fazla bir bakteri ile enfekte edildi ve edilmektedir, bir teknik, tek bakteri seviyesine ölçümü sağlar ihtiyaç vardır. (Ayrıca phagosomal koruma deneyi olarak da bilinir) Diferansiyel permeabilization bu çözünürlük 2,4,10,12 sağlar. deney sağlam vakuolar membranlar bırakır deterjan digitonin ile konakçı hücre, plazma zarının seçici geçirgenliği göre ve böylece antikorlar ile sitosolik bakteri seçici boyanmasını izin verir. Burada diferansiyel permeabilization kullanarak sitozolik ve vakuolar Salmonella typhimurium ölçümü için iki protokol sağlar. Bu yöntemin prensibi, Şekil 1 &#39;de tarif edilmektedir: Kemik iliği türevli makrofajlar (BMDMs) durağan faz Salmonella MCherry-ifade ile enfekte edilir. Sabit faz Salmonella t gerekOnlar faaliyet aksi NLRC4 inflammasome tarafından tanınan ve BMDMs 15 hızlı hücre ölümünü (pyroptosis) neden olacağını SPI-1 T3SS, ifade downregulate çünkü o kullanılır. Hücreler yıkandı ve 1 dakika için digitonin 50 ug / ml ile muamele edilir enfeksiyonu takiben. Hücreler hemen tekrar yıkandı ve sitoplazmada erişimi olan bakteri işaretlemek için FITC bağlanmış anti-Salmonella antikorlar ile inkübe edilir. Adım hücreler parçalanır ek yıkama ve MCherry + (vakuolar) ve FITC + / MCherry + (sitosolik) bakteri yüzdesi sonra FACS ile tespit edilir. Ayrıca herhangi bir floresan proteini eksprese eden suşlar mevcuttur (Şekil 2) ise kullanılabilecek bu yöntemin bir uyarlamasını sunulmuştur. Ek adımlar hücreler, sabit ve tamamıyla geçirgen olan FITC etiketleme sonra katılır. Bundan sonra, tüm bakteriler anti-Salmonella antikorlar ve buna tekabül eden ikincil antikor ile boyandı. Detection daha sonra yerine FACS analizinin mikroskobu ile yapılır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5628</td>
			<td>50ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>mpbio</td>
			<td>219998380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>791733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Salmonella CSA-1-FITC</td>
			<td>KPL</td>
			<td>01-91-99-MG</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Salmonella CSA-1</td>
			<td>KPL</td>
			<td>02-91-99-MG</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Calnexin</td>
			<td>Enzo Lifesciences</td>
			<td>SPA-860D</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PDI</td>
			<td>Enzo Lifesciences</td>
			<td>SPA-890</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vectorlabs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit antibody-488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-11070</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15710-49</td>
			<td>100ug/mL and 10ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Amimed</td>
			<td>5-13K00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>imaging done at 63x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fortessa</td>
			<td>BD technologies</td>
			<td></td>
			<td>detection mCherry 610 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fortessa</td>
			<td>BD technologies</td>
			<td></td>
			<td>detection FITC 530 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cytosolic vs. vacuolar salmonella in primary macrophages by differential permeabilization

Hücre içi bakteriyel patojenler sitosolde veya özel patojen içeren vakuol (PCVS) &#39;de çoğaltabilirsiniz. Sitoplazmada ulaşmak için, Shigella flexneri&#39;ye ve Francisella novicida gibi bakteriler fagozomun rüptürü ikna etmek gerekir. Bunun aksine, Salmonella typhimurium, Salmonella-ihtiva-eden vakuol (SCV) olarak bilinen bir vakuolar bölmesi içinde çoğaltılır. Salmonella Ancak bazı mutantlar SCV bütünlüğünü korumak için başarısız ve böylece sitozolüne salınır. Tek bir bakteri seviyesine vakuolar bakteri genel sitosolik yüzdesi da fagosom-koruma deneyi olarak bilinen, ayırıcı permeabilization ile ölçülebilir. yaklaşım deterjan digitonin mülkiyet kullanımı seçici kolesterol bağlamak için yapar. Plazma membranı diğer hücre membranları daha fazla kolesterol içerdiği, Digitonin hücre içi zarlar bırakırken seçici plazma membran geçirgenliği kullanılabilirbozulmamış. Floresan markör proteinin (diğerleri arasında, örneğin MCherry) ifade patojen ile kısa süreli, enfeksiyona, konakçı hücrelerin plazma membran tampon içeren digitonin kısa bir kuluçkalama permeabilize edilmiştir. Hücreler daha sonra yıkandı ve inkübe tercih bakteriye karşı yönlendirilmiş (seçim bir flüorofora bağlı), bir primer antikor ile (örneğin, anti-Salmonella -FITC) ile tekrar yıkanır. İşaretlenmemiş bakteriler kullanıldığı takdirde, ilave bir aşama olduğu tüm zarlar geçirgen ve tüm bakteri karşılık gelen bir antikor ile boyandı, yapılabilir. Boyama işleminin ardından, vakuolar ve sitosolik bakteri oranı, tek veya çift-pozitif olaylar sayarak, FACS ya da mikroskop ile tayin edilebilir. Burada bakteri Salmonella typhimurium, bu tekniğin kullanımı için deneysel ayrıntıları sunmaktadır. Bu testin bir avantajı, diğer deneyde tersine, tekli bacte düzeyinde bir ölçümü sağlar, kiRia, mikroskopi ile analiz edildi ve eğer belirli bir hücrede sitosolik ve vakuolar bakterilerin tam sayısını içerir.

Şekil 1 ve Şekil 2, bir protokol 1 ve protokol 2 protokolde önemli adımlar ve elde edilen sonuçları gösteren tarif digitonin tahlilinin şemaları göstermektedir. 3 tipik bir FACS sonuçları göstermektedir. Pozitif ve negatif kontroller mCherry + / FITC- bakteriler (Salmonella vakuolar) ve mCherry + / FITC + bakteri (Salmonella sitozolik) için kapılarını ayarlamak için kullanılır. Bu kapılar göre sitosolik ve vakuolar bakteri yüzdesi de...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization at JoVE.com

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Koful genel Sitosolik kantifikasyonu<em&gt; Salmonella</em&gt; Diferansiyel permeabilizasyon tarafından İlköğretim Makrofagların içinde

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

quantification-cytosolic-vs-vacuolar-salmonella-primary-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

10.8K Görüntüleme.  University of Basel. We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.