우리는 토론 마티아스 S. 딕, 롤랜드 F. DREIER과 세바스찬 RUHL을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 SNSF 교수 PP00P3_139120 / 1 PB에 대학 바젤의 프로젝트 보​​조금 ID2153162에 의해 지원되었다

살모넬라 균을 mCherry가 발현 1. 디기 토닌 분석 (분석 FACS 기반) <ol><li> 준비 박테리아 주 : 플라스미드 (PFPV가 rpsM 프로모터하에 mCherry을 코딩)에서 mCherry 발현 살모넬라 야생형 SL1344은 (스트렙토 마이신 내성)이 분석에 사용된다. mCherry의 구성 적 발현에 의해 변경되지 세균 증식 식세포 16 (데이터는 보이지 않음). <ol><li> 37 ° CO / N에서 통에 스트렙토 마이신 (90 μg의 / ㎖) 및 암피실린 (100 ㎍ / ml의 mCherry 발현 벡터)와 보충 LB 배지 3 ㎖에 감염되기 전에 변형 일일 접종. </li></ol></li><li> 감염 세포를 도금. <ol><li> 1.25 × 105 세포의 밀도로 24 웰 플레이트에 시드 야생형 BMDMs / 웰 주 식세포 배지 1 ㎖에가 (DMEM은 10 % 태아 송아지 혈청 (FCS, 열 - 불 활성화 된 56 ° C, 30 분간으로 보충 ), 1 % HEPES, 1 % 비 필수 아미노산 (NEAA), 1 % L 글루타민, 10 % L929 상등액 (대 식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF로부터의 조정 배지) L929 세포를 제조). 표 1에 따른 종자 우물은 개별 조건을 설명합니다. 컨트롤 (표 1)로 사용 된 우물로 된 커버를 추가합니다. </li><li> 37 ℃ 배양기에서 밤새 인큐베이션하고 세포를 5 % CO 2. </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> 투과성으로 </td><td colspan="3"> 염색 </td></tr><tr><td></td><td> 유리 커버 슬립 </td><td> 살모넬라 </td><td> 디기 토닌 </td><td> 사포닌 </td><td> 안티 살모넬라 </td><td> 안티 Calnexin </td><td> 안티 PDI </td></tr><tr><td> A1 (샘플) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A2 (샘플) </td><td> - / + * </td><td> + </td&gt; <td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A3 (샘플) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A4 (NO 투과성으로 제어) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A5 (완전 투과성으로 제어) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> B1 (calnexin에 대한 염색) </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B2 (calnexin에 대한 염색) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B3 (calnexin에 대한 염색) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> C1 (스테인드) PDI에 대한 </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C2 (PDI에 대한 염색) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C3 (PDI에 대한 염색) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td></tr></tbody></table> 표 1 : 살모넬라, 투과성으로하고, 염색과 이후의 감염 24 웰 형식의 골수 유래 대 식세포 (BMDMs)에 대한 도금 방식 * 프로토콜 1 프로토콜이 완료되어 있는지 여부에 따라 다릅니다.. <ol start="3"><li> 감염 박테리아를 준비. <ol><li> 다음날, PBS에 문화 1:10 희석 PBS 만 제어에 대한 외경 (600)를 측정하여 하룻밤 문화에 살모넬라 균의 농도를 결정한다. 이것은 OD 600 리터로 측정되는 것을 보장분광 광도계의 inear 범위. </li><li> ml의 당 살모넬라 균의 농도를 계산한다. 하나의 OD600은 1 × 109 박테리아에 대응한다. </li><li> 1.25 × 106 세포 / ㎖의 살모넬라의 농도에 도달 할 식세포 배지에서 세균을 희석. </li></ol></li><li> 살모넬라 균과 세포의 감염. <ol><li> BMDMs에서 매체를 제거합니다. 감염되지 않은 제어 우물 (B1-B3, C1-C3)에 대 식세포 매체의 1 ML을 추가합니다. 웰스 A1에 살모넬라 균 현탁액 1 ML을 추가 - A5는 셀 당 10 세균의 감염 (MOI)의 다양성에 도달 할 수 있습니다. </li><li> 감염을 동기화하기 위해 37 ° C에서 300 XG에 15 분 동안 플레이트를 원심 분리기. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2. </li></ol></li><li> 겐타 마이신과 세포 외 살모넬라 균을 죽이는. <ol><li> 1 시간 후 감염에, 인큐베이터에서 접시를 제거하고 0.1 ㎎ / ㎖ 젠타 마이신을 포함하는 대 식세포 매체의 0.1 ml에 추가세포 외 박테리아를 죽일. 모든 셀들이 동일한 방식으로 처리되도록, 짝수 비감염 컨트롤에, 모든 웰에 추가 젠타 마이신. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2. </li></ol></li><li> 세포를 세척. <ol><li> 2 시간 게시물 감염에서 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 모든 우물 일반 DMEM의 1 ml의 2 배 세척 (미리 예열 37 ° C까지)와 대 식세포 매체로 교체 10 ㎍ / ml에 포함 (37 ° C로 미리 예열) &#160; 겐타 마이신은 남아있는 세포 외 박테리아의 성장을 방지합니다. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2. </li></ol></li><li> 세제 및 항체와 신선한 버퍼를 준비. <ol><li> 다만 분석 원하는 시점 전에 1 밀리그램 / KHM 완충액 ㎖ (110 mM의 아세트산 칼륨, 20 mM의 HEPES, 2 mM의의 MgCl 2, 7.3의 pH)에서의 디기 토닌 신선한 스톡 용액을 제조 하였다. 작업 농도 버퍼 주식을 필터와 KHM에 희석50 μg의 디기 토닌 / ㎖의. 또한, 버퍼 KHM, KHM에서 1/100에서 1/100 또는 항 PDI에서 1/500, 안티 calnexin에 FITC (CSA-1-FITC)에 커플 항 살모넬라 항체 0.1 % 사포닌 용액을 조제 버퍼는 3 % BSA로 보충. </li></ol></li><li> 세포 투과성으로. <ol><li> 인큐베이터에서 접시를 제거하고 세척 우물은 KHM 버퍼의 0.5 ㎖로 (37 ° C로 미리 예열) 배. A3 우물의 A5과 B3에 사포닌과 B2 / C2 또는 KHM 버퍼 / C3 (표 1에 따라) - KHM 버퍼를 제거하고 웰스 (A1)에 디기 토닌과 우물 A4와 B1 / C1, KHM 버퍼에 0.25 ㎖의 일반 KHM 버퍼를 추가합니다. 모든 우물이 KHM 버퍼의 0.5 ㎖로 3 배 씻어 즉시 실온에서 정확히 1 분 동안 품어 (37 ° C로 미리 예열). </li></ol></li><li> 차 항체 염색. <ol><li> 적절한 우물에 차 항체 솔루션 (염소 항 살모넬라 -FITC, 250 μL / 웰, 0.1 μg의 / ㎖) KHM 버퍼를 제거하고 추가 (그림 1 </st룽&gt; 표 1). 37 ℃ 배양기에서 15 분 동안 플레이트를 인큐베이션, 5 % CO 2. </li><li> 1 mL의 PBS로 1X 세포를 씻으십시오. </li></ol></li><li> 감염된 세포 (웰스 A1 - A5) : FACS 분석 <ol><li> 워시 세포는 PBS로 3 배 및 0.1 % 트리톤을 포함하는 얼음처럼 차가운 PBS 0.5 mL를 넣어. 세포 집합체를 헤어 셀 스트레이너 캡 5 ㎖ 외과 튜브에 전송합니다. 얼음에 샘플을 유지합니다. </li><li> 외과의 샘플을 분석 할 수 있습니다. 완전히 투과성이 컨트롤을 사용하여, 총 순방향 기반 박테리아 제 및 측면 산란 (FSC / SSC)를위한 게이트를 설정하고 mCherry 신호 (610 ± 20 nm의 나노 필터). </li><li> 다음, 세포질 박테리아 게이트 (FITC + mCherry +)와 액포 박테리아 (FITC-, mCherry +) (그림 3)을 설정하기 위해 충분히 투과성이 아닌 투과성이 컨트롤을 사용하여 총 세균 집단의 FITC 신호를 분석 할 수 있습니다. </li><li> 게이트 설정으로, 시료를 분석 및 대 세포질의 비율을 결정제조사의 프로토콜에 따라 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 액포 박테리아. </li></ol></li><li> 감염되지 않은 투과성으로 컨트롤 (우물 B1 - B3, C1 - C3) : 현미경 <ol><li> 정착 <ol><li> PBS를 제거하고 PBS에 PFA 4 %의 250 μl를 추가합니다. 37 ℃에서 10 분 동안 품어. </li><li> 우물은 1 ml의 PBS로 2 배 세척 및 정착을 해소하기 위해 10 분 동안 PBS 0.1 M 글리신의 250 μl를 추가합니다. 워시 웰 PBS 1 ㎖로 2 배. </li></ol></li><li> 이차 항체 염색. <ol><li> PBS에 적합한 형광 물질에 결합 이차 항체와 함께 1 시간 동안 실온에서 얼룩 투과성으로 컨트롤 사포닌 0.1 % 3 % BSA 완전히 Permeabilize 하시려면 세포로 보충. </li><li> 워시는 1 ml의 PBS로 3 배를 커버 슬립과 DAPI (1.5 μg의 / ml)로 매체를 장착에서 분석 된 커버를 탑재합니다. </li></ol></li><li> 현미경 분석. <ol><li> 공 초점 FLUO을 사용하여 40X 또는 63X 배율에서 컨트롤 된 커버 분석rescence 현미경. 투과성으로 일한 경우, digitonin- 사포닌 투과성이 세포와 PDI는 사포닌 투과성이 세포 (그림 4) 만 염색 모두에 대한 비 투과성이 세포 염색, Calnexin 염색이 없어야합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 레이블이없는 살모넬라 (현미경 기반 분석) 2. 디기 토닌 분석 <ol><li> O / N 문화에 대한 박테리아를 준비합니다. <ol><li> 레이블이없는 살모넬라 야생형 SL1344 접종 (스트렙토 마이신 내성) 37 ° CO / N에서 통에 스트렙토 마이신 (90 ㎕ / ml)이 첨가 된 LB 배지 3 ㎖에 감염 1 일 전. </li><li> 감염 세포를 도금. <ol><li> 1.25 × 105 세포의 밀도로 멸균 된 유리 커버 슬립을 함유하는 24 웰 플레이트에 시드 BMDMs / 웰 식세포 배지 1 ㎖ (DMEM은 10 % 태아 송아지 혈청 (FCS와 디 보완, ​​56 ° C를 보충에,30 분), 1 % HEPES, 1 % L 비 필수 아미노산 (NEAA), 1 % L- 글루타민 및 10 % 상등액 L929). 표 1에 따른 종자 우물은 개별 조건을 설명합니다. </li><li> 37 ℃ 세포 배양기에서 O / N을 부화 및 5 % CO 2. </li></ol></li><li> 감염 박테리아를 준비. <ol><li> 다음날, PBS에 문화 1:10 희석 PBS 만 제어에 대한 외경 (600)를 측정하여 O / N 문화에서 살모넬라 균의 농도를 결정한다. 이것은 OD 600 분광 광도계의 선형 범위에서 측정되는 것을 보장한다. </li><li> 밀리리터 당 살모넬라 균의 농도를 결정합니다. (1)의 OD (600)는 1 × 109 박테리아에 대응한다. </li><li> 1.25 × 106 세포 / ㎖의 살모넬라의 농도에 도달 할 식세포 배지에서 세균을 희석. </li></ol></li><li> 살모넬라 균과 세포의 감염. <oL&gt; <li> 모든 우물에서 매체를 제거합니다. 감염되지 않은 제어 우물에 일반 식세포 매체의 1 ML을 추가 (B1 - B3, C1 - C3). 웰스 A1에 살모넬라 균 현탁액 1 ML을 추가 - A5는 셀 당 10 세균의 감염 (MOI)의 다양성에 도달 할 수 있습니다. </li><li> 감염을 동기화하기 위해 37 ° C에서 300 XG에 15 분 동안 플레이트를 원심 분리기. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2. </li></ol></li><li> 겐타 마이신 외 살모넬라 균을 죽이는. <ol><li> 1 시간 후 감염에, 인큐베이터에서 접시를 제거하고 모든 우물에 세포 외 박테리아를 죽일 1 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신을 포함하는 대 식세포 매체의 0.1 ml를 추가합니다. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2. </li></ol></li><li> 세포를 세척. <ol><li> 2 시간 게시물 감염에서 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 10 μg의 / ㎖를 포함하는 신선한 식세포 매체의 1 ml의 각 웰 배를 씻어 방지하기 위해 겐타 마이신남아있는 세포 외 박테리아의 성장. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2. </li></ol></li><li> 세제 및 항체와 신선한 버퍼를 준비. <ol><li> 다만 분석 원하는 시점 전에 1 밀리그램 / KHM 완충액 ㎖ (110 mM의 아세트산 칼륨, 20 mM의 HEPES, 2 mM의의 MgCl 2, 7.3의 pH)에서의 디기 토닌 신선한 스톡 용액을 제조 하였다. 주식 필터 및 50 μg의 / ㎖의 작업 농도 KHM 버퍼에 희석 디기 토닌의. </li><li> 또한, KHM 완충액 0.1 % 사포닌 용액을 준비 살모넬라 항 -FITC (CSA-1는 0.1㎍ / ㎖) KHM 완충액 1/100에서 1/100 또는 항 PDI에서 안티 calnexin이 보충 된 3 % BSA (항체 농도 재료 표 참조). </li></ol></li><li> 세포 투과성으로. <ol><li> 인큐베이터에서 접시를 제거하고 세척 우물은 KHM 버퍼의 0.5 ㎖로 (37 ° C로 미리 예열) 배. KHM 버퍼를 제거하고 0.25 ㎖의 일반 KHM 버퍼를 추가웰스 A1에 디기 토닌과 우물 A4와 B1 / C1, KHM 버퍼 - A3 및 B2 / 사포닌과 C2 또는 KHM 버퍼 웰스 A5과 B3에 / C3 (표 1 항). 모든 우물이 KHM 버퍼의 0.5 ㎖로 3 배 씻어 즉시 실온에서 정확히 1 분 동안 품어 (37 ° C로 미리 예열). </li></ol></li><li> 차 항체 염색. <ol><li> KHM 버퍼를 제거하고 적절한 우물 (그림 2, 표 1)에 차 항체 솔루션 (염소 항 살모넬라 CSA1-FITC, 250 μL / 웰, 0.1 μg의 / ㎖)를 추가합니다. 37 ℃ 배양기에서 15 분 동안 플레이트를 인큐베이션, 5 % CO 2. 1 ml의 PBS로 세척 배. </li></ol></li><li> 고정. <ol><li> PBS를 제거하고 PBS에 PFA 4 %의 250 μl를 추가합니다. 37 ℃에서 10 분 동안 품어. </li><li> 우물은 1 ml의 PBS로 2 배 세척 및 정착을 해소하기 위해 10 분 동안 PBS 0.1 M 글리신의 250 μl를 추가합니다. 워시 웰 PBS 1 ㎖로 2 배. </li></ol></li><li> 합계감염된 샘플의 살모넬라 균 염색. <ol><li> 물로 0.1 % 사포닌 / 3 % BSA와 함께 PBS와 배를 커버 슬립 및 안티 CSA1 항체 샘플 배양을 1 시간 동안 (염소 항 CSA1는 0.1 ㎍ / ml의 마우스 항 - LPS는 0.1 μg의 / ㎖으로 잘 작동) 사포닌 0.1 % / 3 % BSA와 함께 PBS에서 RT에서. </li><li> 0.1 % 사포닌 / 3 % BSA와 PBS에 세척 배. 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 0.1 % 사포닌 / 3 % BSA와 PBS에 선택의 형광에 결합 된 보조 항 염소 항체로 샘플을 품어. </li><li> 워시는 1 ml의 PBS로 3 배를 커버 슬립과 DAPI (1.5 μg의 / ml)로 매체를 장착에서 분석 된 커버를 탑재합니다. </li></ol></li><li> 현미경 분석. <ol><li> 세포질 살모넬라 (양의 항 살모넬라 -FITC) 총 살모넬라 (더블 플러스) (그림 5)를 계산하여 공 초점 현미경으로 데이터를 수집. 투과성으로 컨트롤을 보여해야합니다 비 투과성이 세포 Calnexin들에 대한 염색을디기 토닌 - 투과성이 세포와 사포닌 투과성이 세포 PDI 염색에 대한 이닝 (그림 4). 웰스 A4와 A5는 살모넬라 오염에 대한 내부 통제를 제공합니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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R., Schlegel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+orientation+of+the+human+papillomavirus+type+16+E5+oncoprotein.">Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein.</a> J Virol. 84, 1696-1703 (2010).</li><li>Keller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+measurements+of+vacuolar+rupture+caused+by+intracellular+pathogens.">Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens.</a> J Vis Exp. , e50116 (2013).</li></ol>

We have nothing to disclose.

차동 투과성으로 분석하고 액포 구획과 세포질 사이의 세균성 병원균의 세포 내 분포를 정량화 할 수있는 쉽고 강력한 방법입니다. 같은 분석은 Francisella novicida 2,4와 시겔 flexneri (12) 박테리아에 성공적으로 사용되어왔다. 많은 세포 내 병원체 변경하거나 호스트 endomembrane 구조를 수정하기 때문에, 디기 토닌의 투과성으로의 견고성은 개별적으로 결정되어야 할 것이...

세균 세포 내 병원체를 직접 숙주 세포의 세포질 또는 전문 액포 구획 중 하나에 복제. 감염의 초기 단계에서 대부분의 병원균 (예 : 대 식세포) 또는 능동적으로 비 식세포로 자신의 흡수를 촉진하여 전문화 된 세포에 의한 식균 작용에 의해 내재화를 얻는다. 식세포에서 phagosome 정상적으로 포식 입자 소화 degradative 구획을 형성 리소좀과 융합한다. 이러한 Francisella novicida 또는 시겔 flexneri 같은 전문 세포질 박테리아는 phagosome의 파열을 유도하여 phagosomal 저하를 탈출 이후 세포질 2,3로 탈출. 이는 액포 파열 2-4을 촉진 이펙터 단백질을 주입 Francisella 병원성 섬 (FPI) 또는 시겔 flexneri T3SS, 같은 독성 관련 메커니즘을 필요로한다. 숙주 세포의 세포질 기능일반적 병원체의 존재를 인식하고 5 시그널링 선천성 면역을 유도 보존 패턴 인식 수용체의 수. 또한 xenophagy, 자식 작용의 항균 형태 세포질을 입력 세균을 저하 할 수있다. 박테리아 세포질 통상 잘 무딘 또는 다른 전략을 사용하여이 반응을 회피하도록 구성되어있다. 예를 들어, Francisella 호스트 인식을 피하기 위해 LPS를 수정하고 시겔은 분비 이펙터 단백질 6,7를 사용하여 자식 작용 모집을 방지 할 수 있습니다. 리소좀 저하를 탈출하는 또 다른 전략 모델 액포 병원체 살모넬라 엔테 혈청 형 티피 뮤 리움에 의해 고용되어, 그 후 살모넬라 티피 무리 움라고도합니다. 살모넬라 균은 세포 내 틈새 시장에 초기 phagosome 개조 이펙터를 주입하는 T3SS를 사용, 살모넬라 공포 (SCV) 함유 8,9. 호스트 경로의 연속 조작이다필요는 공포에 지질 및 기타 영양소를 보충하여이 공포를 유지합니다. 실제로, 살모넬라 SIFA 돌연변이 액포 안정성을 유지하는 데 실패하고 선천성 면역 경로와 자식 작용 모집 (8)의 활성화를 초래 감염 후 시간 이내에 숙주 세포의 세포질을 입력한다. 살모넬라 공포 성 탈출 연구하다 세포 유형에 따라 다양하고, 여러 가지보고 상피 세포에서도 WT 살모넬라 세포질 10 SCV 및 hyperreplicate 벗어날 수 있다는 것을 보여 주었다. 최근 보고서는 액포 병원균의 선천성 면역 검출도 인식하고 병원체 함유 액포 (PCVs) 11 ~ 14를 불안정하게 할 수있는 호스트의 능력에 달려 있음을 보여준다. 호스트 또는 박테리아 모두 유전자형 액포와 세포질 구획 사이의 세포 내 박테리아의 분포에 영향을 미칠 수 있음을 감안할 때, 그것은 액포 대들의 수를 정량화하는 것이 필요하다세포질 박테리아. , 이후 가장 실험 셋업에서 숙주 세포는 다른 세포 내 구획에서 여러 박테리아를 가질수이어서 하나 이상의 박테리아로 감염되고, 기술은 단일 박테리아의 수준을 정량화 허용하는 필요하다. (또한 phagosomal 보호 분석라고도 함) 차동 투과성으로는이 해상도 2,4,10,12를 제공합니다. 분석은 그대로 액포 막 잎 세제 디기 토닌와 숙주 세포 혈장 막의 선택적 투과성으로 기반으로하며, 따라서 항체의 선택적 박테리아 세포질 염색을 허용한다. 여기에서 우리는 차동 투과성으로를 사용하여 세포질과 액포 살모넬라 균의 정량이 프로토콜을 제공합니다. 이 방법의 원리는 그림 1에 설명되어 있습니다 : 골수 유래 대 식세포 (BMDMs)은 정지상이 살모넬라 균을 mCherry 발현에 감염된다. 고정상 살모넬라 균은 T가 필요그들이 활성 그렇지 NLRC4의 inflammasome을 인식하고 BMDMs 15의 신속한 세포 사멸 (pyroptosis)를 유도 할 것이다 T3SS SPI-1의 발현을 하향 조절하기 때문에 O 사용될. 세포를 세척하고 1 분간의 디기 토닌를 50㎍ / ㎖로 처리하여 감염에 이어. 세포를 다시 세척하고, 즉시 세포질에 접근 박테리아 마크 FITC 결합 항 살모넬라 항체와 함께 배양한다. 단계의 세포가 용해되어 추가 세척 및 mCherry + (액포)과 FITC + / mCherry + (세포질) 박테리아의 비율 후 FACS에 의해 결정된다. 우리는 또한 더 형광 단백질 발현 균주를 사용할 수는 (그림 2)없는 경우에 사용할 수있는이 방법의 적응을보고합니다. 추가 단계는 세포 투과성이 완전히 고정되는 FITC 표지 후에 도입된다. 그 후 모든 박테리아는 항 살모넬라 항체 및 해당 이차 항체로 염색된다. DETection은 다음 대신 FACS 분석의 현미경으로 이루어집니다.

<table><tbody><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D5628</td><td>50 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>PFA</td><td>mpbio</td><td>219998380</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Acetate</td><td>Sigma</td><td>791733</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>anti-Salmonella CSA-1-FITC</td><td>KPL</td><td>01-91-99-MG</td><td>1/500</td></tr><tr><td>anti-Salmonella CSA-1</td><td>KPL</td><td>02-91-99-MG</td><td>1/500</td></tr><tr><td>anti-Calnexin</td><td>Enzo Lifesciences</td><td>SPA-860D</td><td>1/100</td></tr><tr><td>anti-PDI</td><td>Enzo Lifesciences</td><td>SPA-890</td><td>1/100</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium</td><td>Vectorlabs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Anti Rabbit antibody-488</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11070</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15710-49</td><td>100 &amp;mu;g/ml and 10 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Amimed</td><td>5-13K00-H</td><td></td></tr><tr><td>LSM700 Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>imaging done at 63X</td></tr><tr><td>FACS Fortessa</td><td>BD technologies</td><td></td><td>detection mCherry 610 nm</td></tr><tr><td>FACS Fortessa</td><td>BD technologies</td><td></td><td>detection FITC 530 nm</td></tr></tbody></table>

quantification of cytosolic vs. vacuolar salmonella in primary macrophages by differential permeabilization

세포 내 세균 병원체는 세포질 또는 전문 병원체 함유 액포 (PCVs)에 복제 할 수 있습니다. 세포질에 도달하기 위해, 시겔 flexneri 및 Francisella novicida 같은 박테리아는 phagosome의 파열을 유도 할 필요가있다. 대조적으로, 살모넬라 티피 무리 움 살모넬라 함유 액포 (SCV)라고도 액포 구획에 복제. 그러나 특정 살모넬라 돌연변이 SCV 무결성을 유지하는 데 실패함으로써 세포질로 방출된다. 세균의 하나의 레벨에 액포 박테리아 대 세포질의 비율은 phagosome 보호 분석법으로 알려진, 미분 투과성으로하여 측정 할 수있다. 접근 방식은 세제 디기 토닌의 재산의 사용이 선택적으로 콜레스테롤을 결합 할 수 있습니다. 세포막 다른 세포막 이상의 콜레스테롤을 포함하고 있으므로, 디기 토닌는 세포 막을 남기고 선택적으로 세포막을 Permeabilize 하시려면하는데 사용될 수있다그대로. 형광 마커 단백질 (예 중에서도 mCherry)를 발현하는 병원체 간략히, 다음의 감염, 숙주 세포의 세포막을 함유 디기 토닌 완충액으로 짧은 인큐베이션으로 투과성이있다. 세포를 세척하고 배양 한 다음 선택의 세균에 대해 유도 (원하는 형광 물질에 결합) 일차 항체 (예, 항 -FITC 살모넬라) 다시 세척한다. 도장이 박테리아가 사용되는 경우, 부가적인 단계가있는 모든 막을 투과 가능하며 모든 박테리아에는 해당 항체로 염색 할 수있다. 염색 후, 액포와 세균의 세포질 비율은 단일 또는 이중 양성 이벤트를 카운트하여 FACS 또는 현미경에 의해 정량화 될 수있다. 여기에서 우리는 박테리아 살모넬라 티피 무리 움이 기술의 사용을위한 실험적인 세부 사항을 제공합니다. 이 분석의 장점은 다른 분석 달리, 그것이 단일 bacte의 수준 정량을 제공한다는 것이다RIA, 현미경으로 분석 한 경우, 소정의 셀에서의 세포질과 액포 박테리아의 정확한 숫자를 제공한다.

도 1 및도 2는도 1 및 프로토콜이 프로토콜은 프로토콜의 중요한 단계 및 수득 한 결과를 나타내는 디기 토닌에 기재된 분석법의 회로도를 도시한다. 3 FACS 전형적인 결과를 나타낸다. 긍정적이고 부정적인 컨트롤은 mCherry + / FITC- 박테리아 (액포 살모넬라) 및 mCherry + / FITC + 박테리아 (세포질 살모넬라 균)의 게이트를 설정하는 데 사용됩니다. 이들 게이트에 근거...

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Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

공포 성 대 세포질의 정량화<em&gt; 살모넬라</em&gt; 차동 투과성으로하여 기본 대 식세포에서

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

quantification-cytosolic-vs-vacuolar-salmonella-primary-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

10.8K 조회수.  University of Basel. We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

비디오: Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

연구

생체공학

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

면역학 및 감염병학

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

표현형 높은 처리량 분석<em&gt; 살모넬라 엔테</em&gt; 티피 뮤 리움 협회, 침략, 그리고 대 식세포에서의 복제

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

형광 나노 입자의 응용 프로그램은 세포 내 세균에 의해 엔도 - 리소좀 시스템의 리모델링을 연구하기 위해

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate hosts, respectively. While pathogenic symptoms of leishmaniasis can vary widely, from benign cutaneous lesions to highly fatal visceral disease forms depending on the infective species, all Leishmania species reside inside host macrophages during the vertebrate stage of their lifecycle. Leishmania infectivity is therefore directly related to its ability to invade, survive and replicate within parasitophorous vacuoles (PVs) inside macrophages. Thus, assessing the parasite&#39;s ability to replicate intracellularly serves as a dependable method for determining virulence. Studying leishmaniasis development using animal models is time-consuming, tedious and often difficult, particularly with the pathogenically important visceral forms. We describe here a methodology to follow the intracellular development of Leishmania in bone marrow-derived macrophages (BMMs). Intracellular parasite numbers are determined at 24 h intervals for 72 - 96 h following infection. This method allows for a reliable determination of the effects of various genetic factors on Leishmania virulence. As an example, we show how a single allele deletion of the Leishmania Mitochondrial Iron Transporter gene (LMIT1) impairs the ability of the Leishmania amazonensis mutant strain LMIT1/&#916;Lmit1 to grow inside BMMs, reflecting a drastic reduction in virulence compared to wild-type. This assay also allows precise control of experimental conditions, which can be individually manipulated to analyze the influence of various factors (nutrients, reactive oxygen species, etc.) on the host-pathogen interaction. Therefore, the appropriate execution and quantification of BMM infection studies provide a non-invasive, rapid, economical, safe and reliable alternative to conventional animal model studies.

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

All pathogenic Leishmania species reside and replicate inside macrophages of their vertebrate hosts. Here, we present a protocol to infect murine bone marrow-derived macrophages in culture with Leishmania, followed by precise quantification of intracellular growth kinetics. This method is useful for studying individual factors influencing host-pathogen interaction and Leishmania virulence.

대 식 세포 안의 세포내 성장의 정량화는 빠르고 Leishmania 기생충의 독성을 평가 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.

녹색 형광 단백질 표현 하는 향상 된 사용 하 여 대장균 마우스 복 막 대 식 세포 식 균 작용을 평가 하기 위해

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (cytosolic hyper-replication). These different phenotypes of intracellular replication drive to different pathways of pathogenesis, i.e., cytosolic hyper-replication induces inflammatory cell death and extrusion into the gut lumen, while vacuolar replication leads to trans-epithelium penetration and systemic spread. Significant effort was made to create microscopy tools to study the behavior of Salmonella inside invaded cells, such as the pCHAR-Duo fluorescence reporter plasmid that allows discrimination between vacuolar and cytosolic bacteria by differential expression of mCherry and GFP. However, intracellular phenotypes are often manually scored, a time-consuming procedure that limits analysis to a small number of samples and cells. To overcome these limitations, two complementary and automated image analyses were developed using ImageJ, a freely available image analysis software. In the high-throughput protocol, epithelial cells were infected with Salmonella carrying pCHAR-Duo using 96-well plates. Imaging was performed using an automated fluorescence microscope. Then, two image analysis methods were applied to measure the intracellular behavior of Salmonella at different detail levels. The first method measures the overall intracellular bacterial load and the extent of cytosolic hyper-replication. It is fast and allows the scoring of a high number of cells and samples, making it suitable for high-throughput assays such as screening experiments. The second method performs single-cell analysis to determine the percentage of infected cells, the mean vacuolar load of Salmonella, and the cytosolic hyper-replication rate giving greater details about Salmonella behavior inside epithelial cells. The protocols can be performed by specifically designed ImageJ scripts to automatically run batch analyses of the major steps of Salmonella-enterocyte interaction.

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella invades and replicates inside intestinal epithelial cells both in Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (hyper-replication). A high-throughput fluorescence microscopy-based protocol is described here to quantify the intracellular phenotypes of Salmonella by two complementary image analyses through ImageJ, reaching single-cell resolution and scoring.

ImageJ를 이용한 살모넬라균 의 세포내 표현형 자동 분석

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free ...

Assessment of Leishmania Virulence within Cultured Macrophages

Source: Sarkar, A. et al., <a href="https://app.jove.com/v/57486">Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of&#160;Leishmania&#160;Parasites.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018)
This video investigates Leishmania&#39;s virulence by treating macrophages with metacyclic promastigotes, resulting in the formation of intracellular amastigotes. The confirmation of Leishmania&#39;s virulence is achieved through nucleic acid fluorescent dye staining. This insight can contribute to the development of new therapies for leishmaniasis.

배양된 대식세포 내 Leishmania Virulence 평가

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Imaging and Visualization Techniques

An In Vitro Assay to Quantify the Intracellular Growth of Parasite in Macrophages

Source: Sarkar, A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57486">Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates an assay to quantify the intracellular growth of parasites in bone marrow-derived macrophages (BMMs). The macrophage cells are infected with the motile and non-motile invasive stages of Leishmania, metacyclic promastigotes and amastigotes, respectively. The parasites invade the macrophages, getting internalized into a parasitophorous vacuole and multiplying inside. The intracellular parasite growth is quantified using a microscope upon fluorescently staining the macrophage and parasite nuclei.

대식세포에서 기생충의 세포 내 성장을 정량화하기 위한 In vitro 분석

1. Plating BMMs on Coverslips for Infection 

	Prepare 6-well tissue culture plates by placing four (4) sterile 12 mm glass coverslips (autoclaved and ...

공포 성 대 세포질의 정량화

요약

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