This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.

NOTE: Certaines étapes du protocole ci-dessous ont besoin de travailler dans une hotte propre. En outre, la méthode nécessite une dissection microscope levure tétrade équipé d&#39;un objectif à distance 10X long travail chargé de suivre sphéroplastes. Le microscope devrait être mis en place dans la hotte à l&#39;avance. Retirez le bras de micromanipulateur et support de plaque de la portée et de placer ces éléments dans un endroit sûr, loin de la zone de travail. 1. Préparation des sphéroplastes <ol><li> Cultiver la levure dans des conditions souhaitées. Utilisez environ 2 x 10 8 cellules pour chaque échantillon, par exemple 4 ml d&#39;une culture à DO600 = 1,4 x 10 5 7 cellules / ml. Bien que le traitement immédiat d&#39;échantillons peut être préférable dans certains cas, pour la plupart des applications, des aliquotes de cellules peuvent être stockés sur de la glace pendant jusqu&#39;à 8 heures avant d&#39;être traité. </li><li> Transfert suspension de cellules dans un tube de 15 ml centrifugeuse et de spin dans une centrifugeuse clinique à mettre en 5 (2345 tr / 857,5 x g) pendant 3 min pour sédimenter les cellules. </li&gt; <li> Décanter la prise moyenne soin de ne pas perdre des cellules du culot. Resuspendre doucement les cellules dans un tampon de ZK 1 ml, puis ajouter 40 pi 1 M dithiothréitol (DTT). Incuber 2 min en mélangeant doucement. Cellules à granules comme avant (voir l&#39;étape 1.2). </li><li> granulés de remettre en suspension dans un tampon de ZK 1 ml. Ajouter 5 ul d&#39;une solution fraîchement préparée de zymolyase 100T qui a été bien mélangé. Incuber pendant 20-30 min à 30 ° C pour éliminer la paroi cellulaire et produire des sphéroplastes. </li><li> Doser une goutte de 10 pi de suspension de cellules sur une lame de microscope pour déterminer si sphéroplastes est terminée. Cellules vues sous le microscope de dissection sans une lamelle. Les cellules doivent apparaître pléthorique et rond plutôt que légèrement oblongue et devraient lyser après l&#39;addition de 20 pi d&#39;eau. Si les cellules ne parviennent pas à lyser, retourner l&#39;échantillon à 30 ° C et re-test toutes les 10 min jusqu&#39;à ce que l&#39;eau induite par la lyse est facilement observé. Cellules à granules comme avant (voir l&#39;étape 1.2). </li><li> Resuspendre doucement et laver culot cellulaire in 2,5 ml MES / tampon de sorbitol froid. Cellules à granules comme avant (voir l&#39;étape 1.2). Resuspendre doucement culot cellulaire dans 300-400 MES / tampon de sorbitol ul froid. Les cellules peuvent être conservés dans la glace à ce stade pendant plusieurs heures. </li></ol> 2. Chromosome épandage REMARQUE: Les surfaces de verre sur laquelle les chromosomes seront répartis soit-diapositives ou lamelles couvre-devrait être préparée à l&#39;avance. Chaque diapositive ou lamelle devraient être immergés dans l&#39;eau, puis EtOH, puis on le laisse sécher, et poli avec du papier de verre. Si chromosomes seront répartis sur des lamelles, la lamelle doit être apposée sur une diapositive avec du scotch ou du ciment en caoutchouc. Sauf mention contraire, le reste du protocole décrira propagation soit sur une diapositive ou lamelle <ol><li> Aide d&#39;une pipette P20, pipette 20 ul de suspension cellulaire sur la surface d&#39;une lame propre. </li><li> Aide d&#39;une pipette P200, ajouter 40 pi de la PFA / solution de saccharose à 3% et mélanger délicatement la solution par &quot;tourbillonnant&quot; la lame avec la main jusqu&#39;à ce que les lignes disparaissent Schlieren. Placez glisser sous microscope et confirment que les cellules sont en discussion. La solution PFA devrait être fraîchement préparé dans la hotte sur le jour d&#39;utilisation. REMARQUE: si la protéine d&#39;intérêt n&#39;a pas été examiné par la méthode précédemment, il est souhaitable de préparer des diapositives supplémentaires à l&#39;aide de solutions contenant 2 et 4% de PFA afin de déterminer si la rétention de la protéine est sensible aux conditions de fixation. Une solution à 4% PFA / saccharose est utilisé dans les cas où il est souhaitable de visualiser les microtubules de tubuline associés. L&#39;inconvénient de la concentration ultérieure fixateur est que les chromosomes seront &quot;underspread,&quot; 2% de PFA a également tendance à donner chromosomes &quot;underspread&quot;. </li><li> Aide d&#39;une pipette P200, ajouter 80 pi de 1% Lipsol, tourbillonner comme avant de mélanger des solutions aussi complètement que possible, commencer une minuterie. Si Lipsol ne sont pas disponibles, 80 ul de 1% de NP40 ou 80 ul dH 2 O peuvent êtresubstitué (voir résultats représentatifs, Figure 2). </li><li> Regardez les cellules soigneusement et agiter doucement la lame toutes les 15 secondes. Lorsque environ 80% des cellules ont lysées (disparu) arrêter la minuterie, retirer immédiatement la lame du microscope, ajouter 80 pi de PFA / solution de saccharose, et agiter pour mélanger. Lysis devrait se produire à partir de entre 30 et 90 secondes après le démarrage de la minuterie. NOTE: Si plusieurs diapositives montrent lyse à peu près le même temps, on peut éventuellement omettre surveillance microscopique pour le reste des diapositives et simplement du temps soigneusement la période entre l&#39;addition de lipsol et l&#39;ajout de l&#39;aliquote finale de fixateur. Cependant, ce raccourci est fiable que lors de la préparation de plusieurs diapositives à partir du même échantillon. Il est préférable de contrôler la lyse de chaque échantillon au microscope lorsque différentes lames sont préparés à partir d&#39;échantillons prélevés à des moments différents ou de différentes cultures. </li><li> Placez la lame sur une surface plane et propre et répandre le liquide sur toute la surfac non glacése de la diapositive à l&#39;aide du côté d&#39;un propre, des pâturages pipette jetable est tenue au-dessous de la surface du bain de la &quot;flaque&quot;, mais au-dessus de la surface de la glissière elle-même, à savoir. ne pas &quot;ratisser&quot; la surface de la lame avec la pipette. Ne pas réutiliser pipette sur différentes diapositives pour éviter la contamination des échantillons. </li><li> Laisser les lames sécher pendant la nuit dans la hotte. Composants nucléaires insolubles se déposent sur la surface de glissement et de se lier à lui. Pour les grandes expériences, la planification de l&#39;utilisation de l&#39;espace pour l&#39;étape de séchage est important. </li><li> Une fois séchées, des résultats optimaux sont obtenus en progressant à l&#39;étape de immunocoloration le même jour. Cependant, la solution de saccharose séché incorpore les chromosomes d&#39;étalement dans un &quot;miel&quot; qui permet la congélation des échantillons: diapositives peuvent être transférées à une boîte de glissement en matière plastique et stockées à -20 ° C pendant des années. </li></ol> 3. Immunocoloration <ol><li> Tremper les lames à 0,2% Photo-Flo pour 30 sec. pour enlever le miel. Diapositives sur Leanun bord, avec le bord reposant sur une serviette en papier, pour supprimer résiduelle Photo-Flo. </li><li> Tremper les lames en 1x TBS pendant 5 minutes pour se laver. Retirer l&#39;excès de liquide en se penchant diapositives sur un bord, mais ne les laissez pas sécher. </li><li> Lay diapositives givrées vers le haut, pipette 300 ul TBS / BSA sur la lame à travers la partie non glacés de la diapositive. </li><li> Incuber dans une chambre humide à température ambiante pendant 15 min. (Récipient en plastique grande avec des serviettes en papier de l&#39;eau saturée sous une boîte de glissement de plaque de métal ou de plastique perforé avec des serviettes en papier saturées). </li><li> Égoutter diapositives en se reposant un bord court de la lame sur une serviette en papier et appuyé la lame contre un support approprié (comme un porte-tube à essai). Ne pas laisser sécher la surface. </li><li> Appliquer immédiatement 80 pi de tampon TBS / BSA contenant la dilution appropriée de l&#39;anticorps primaire. Si l&#39;anticorps est de limiter, utiliser 40 pi et une lamelle mm 22 x 22. Pour sérum de lapin brut, cela est généralement entre une dilution 1/50 et 1/500. NOTE:Effectuer des titrages pour les nouvelles préparations d&#39;anticorps. La préparation la plus diluée que des rendements élevés signal au-dessus de fond est choisie. Pour contrôler le niveau de la coloration de fond, les noyaux doivent être préparés à partir de la souche mutante de suppression approprié et / ou reproduire des diapositives doivent être colorés avec du sérum pré-immun. </li><li> Placez un poli 22 x 50 mm lamelle sur la lame en évitant les bulles. Pour ce faire, en tenant la lamelle entre le pouce et l&#39;index sur le bord long à des positions proches d&#39;un bord court. Tenir la lamelle à un angle de 30 ° par rapport à glisser, le court le plus éloigné du bord des doigts est abaissée jusqu&#39;à ce qu&#39;il repose sur la diapositive juste à l&#39;intérieur du bord de la &quot;flaque&quot; plus proche de la région dépoli de la lame. Ensuite, abaissez lentement la lamelle dans un mouvement lisse jusqu&#39;à ce que les doigts qui tiennent la lame touche le banc, puis relâchez. Ne pas tenter de régler la position de la lamelle une fois qu&#39;il atterrit. NOTE: Si des étalements de chromosomes ont été préparés surapposés lamelles (plutôt que directement sur la surface des lames), cette lamelle échantillon restera fixée à la glissière au cours des étapes de lavage et de coloration. Une lamelle supplémentaire sera placé sur le dessus de l&#39;échantillon lamelle afin de répartir uniformément la solution d&#39;anticorps pendant la coloration, puis jetés. </li><li> Placer les lames dans une chambre humide scellé et incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Tenir le transfert de bord dépoli les diapositives à un support de coloration de lame de verre et plonger dans un bocal contenant de coloration SCT. </li><li> Plonger doucement la lame de haut en bas pour enlever la lamelle. Essayez de ne pas utiliser trop de force pour ce faire. Laver les lames 2x 10 min en immergeant dans du TBS. Sortir les lames de rack et drainer l&#39;excès de liquide en touchant bord à serviette en papier. Ne pas laisser sécher la surface. </li><li> Travaillant sous une lumière tamisée, ajouter immédiatement 80 pi TBS / BSA contenant un 1 / 1.000 dilution d&#39;anticorps secondaire conjugué fluorochrome (ou 40 pi avec un 22 x 22 mm lamelle). Annonced lamelle comme avant et incuber à 4 ° C pendant 2 heures dans la chambre humide dans l&#39;obscurité. </li><li> Retirer lamelles comme avant, les égoutter diapositives, et permettre à la surface sécher à l&#39;air de 1 à 2 h dans l&#39;obscurité. Lean diapositives sur des serviettes en papier comme avant. NOTE: Si la diffusion a été effectuée sur une lamelle montée, détachez la lamelle de la lame avant de sécher. Lamelles sont ensuite séchées de la manière décrite pour les diapositives dans l&#39;étape précédente. </li><li> Travaillant sous lumière tamisée, ajouter environ 30 pi de milieu contenant DAPI (trois 10 Les gouttelettes pi) de montage, puis abaissez délicatement une lamelle. Si les écarts sont sur des lamelles, placer les gouttelettes de milieu de montage sur une lame propre et abaisser la lamelle, côté chromosome bas, sur la diapositive. </li><li> Toujours sous lumière tamisée, attendre 2 min pour lamelle de régler et sceller les bords de la lamelle avec vernis à ongles transparent. Placez les diapositives dans une boîte de tiroir plat. NOTE: Pour la microscopie STED, monter avec ProLong Or. Utilisez 30 pi de ProLong Orsans DAPI et laisser sécher durant la nuit. Étanchéité avec le vernis à ongles est inutile. </li><li> Voir les diapositives par microscopie à épifluorescence grand champ avec un 40 ou un objectif 100X en utilisant un filtre approprié pour définir DAPI se concentrer. Éventuellement stocker la lame dans l&#39;obscurité à 4 ° C pendant plusieurs semaines. Ne pas congeler. </li></ol>

<ol><li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li>
<li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li>
<li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li>
<li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li>
<li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+identifies+Monopolin%3A+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li>
<li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+RecA-like+recombinases%3A+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li>
<li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1%2FAurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes & Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li>
<li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li>
<li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li>
<li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+%3A+a+publication+of+the%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li>
</ol>

The authors declare no competing financial interests.

The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize...

La levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae présente de nombreux avantages pour les études des mécanismes moléculaires des processus biologiques, y compris l&#39;étude des protéines qui contrôlent la fonction de chromosome. Bien qu&#39;il existe des avantages bien connus de la levure bourgeonnante pour les études génétiques, moléculaires et biochimiques, les études cytologiques de la distribution des protéines dans le noyau de la cellule est compliquée par sa petite taille. Le noyau de la levure typique a un diamètre de moins d&#39;un micron, ce qui est seulement d&#39;environ 5 fois la limite de résolution de la lumière visible. Ainsi, la quantité d&#39;informations à propos de la distribution des protéines nucléaires qui peuvent être obtenus à partir de immunocoloration classique ou en utilisant les mots-clés de protéines fluorescentes telles que la protéine fluorescente verte (GFP), est limitée. Une approche utile pour caractériser la répartition des protéines est subnucléaire surface de chromosome se propager. Cette approche consiste à enlever la paroi cellulaire, perturbant les membranes cellulaires et nucléaires, et unllowing le contenu insolubles du noyau de se déposer sur la surface d&#39;une lame de microscope. Ces composants insolubles comprennent la matrice nucléaire et les chromosomes. En plus de permettre l&#39;enlèvement des matières nucléaires solubles, ce qui améliore la capacité de détecter les protéines liées de la chromatine, le chromosome d&#39;étalement méthode conduit à une décompression importante des chromosomes tels que les noyaux de propagation ont des diamètres de l&#39;ordre de 3 à 5 um (pour les noyaux méiotiques diploïdes) et 2 à 3 um pour les noyaux mitotiques diploïdes. Cette décompression permet la détection de sous-structure nucléaire qui est relativement difficile, voire impossible à résoudre dans les noyaux intacts. Un inconvénient évident de chromosome d&#39;étalement est la possibilité que la procédure d&#39;étalement peut partiellement ou complètement perturber la structure d&#39;intérêt. Il est particulièrement préoccupant que un chromosome lié protéine particulière pourrait être perdu à la suite de la procédure se propager. Cette shou de complication potentielleld être gardé à l&#39;esprit lors de l&#39;interprétation des données. Un exemple d&#39;une protéine qui est sensible à la procédure d&#39;étalement est la bêta-tubuline. Dans certaines conditions, la broche, qui est constitué principalement de la tubuline, est conservée lors de l&#39;épandage 3. Visualisation de la broche est souvent utile de mettre en scène des noyaux d&#39;intérêt. Cependant, la visualisation de la tubuline nécessite un traitement avec un fixateur haute concentration; les broches sont perdus dans les conditions standards décrites ci-dessous. Cet exemple illustre le fait que, lors de l&#39;analyse de la répartition d&#39;une protéine non caractérisée précédemment, il est important de faire varier la concentration de fixateur afin de déterminer la sensibilité de la protéine est d&#39;une telle variation. En dépit de l&#39;inquiétude quant à l&#39;impact des conditions d&#39;épandage sur la structure des chromosomes, l&#39;utilité et la puissance de la méthode de propagation ont été mis en évidence dans de nombreux contextes et a une large utilité dans la caractérisation des mitotique et, en particulier les cellules méiotiques 4-7. Two méthodes d&#39;épandage ont été largement utilisés. La première de ces méthodes, développées par Dresser et Giroux 8, évite l&#39;utilisation de détergent et peut produire des préparations propagation qui semblent avoir relativement bien conservé la morphologie des chromosomes lors teinté pour le colorant DAPI spécifique d&#39;ADN. Cependant, ce procédé est relativement difficile de mettre au point et à la qualité des noyaux de propagation varie considérablement, quand une zone d&#39;une diapositive est comparée à d&#39;autres régions. Ce problème peut compliquer approches quantitatives qui impliquent l&#39;imagerie de nombreux noyaux non sélectionnés d&#39;une diapositive à éviter que des données biais d&#39;acquisition. La deuxième méthode d&#39;étalement chromosome, développé par Klein et Loidl 1, implique la fixation d&#39;équilibrage par le paraformaldéhyde, avec lyse et la décompression de la chromatine promu par une solution de détergent. Lorsqu&#39;il est correctement effectuée, cette méthode donne des résultats très reproductibles avec moins de variation de région à région par rapport à la méthode Dresser et Giroux. Cette présentation se concentre sur un modifiela version d de la méthode de Loidl et Klein, en raison de sa fiabilité et sa simplicité. Chromosome propagation est pas compliqué ou de temps; jusqu&#39;à 100 diapositives peuvent être préparés par immunocoloration en une seule journée. En outre, les préparations de propagation peuvent être stockés dans le congélateur pendant des années avant immunocoloration, et donc les laboratoires peuvent développer un référentiel des étalements de chromosomes congelés qui peut être utilisé lorsque de nouvelles questions se posent ou biologiques nouveaux réactifs de coloration deviennent disponibles. Le procédé d&#39;étalement de chromosomes est le plus couramment utilisé en combinaison avec une immunocoloration et la microscopie à fluorescence à grand champ, mais il est également possible de préparer des lames pour les méthodes microscopiques super-résolution légers tels que l&#39;épuisement de l&#39;émission stimulée (STED) microscopie.

<table><tbody><tr><td>Zymolyase</td><td>US Biological&amp;nbsp;</td><td>Z1004</td><td>Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4&amp;deg;C until ready for use.</td></tr><tr><td>Lipsol&amp;nbsp;</td><td>L.I.P. Ltd&amp;nbsp;</td><td>no longer commercially available</td><td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>USB</td><td>19628</td><td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Standard coverslip</td><td>Fisher</td><td>12-544-E or 12-540-B</td><td></td></tr><tr><td>High resolution coverslips</td><td>Fisher</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 solution</td><td>Kodak</td><td>P-7417</td><td>Prepare 0.2% (v/v) solution in water.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4&amp;deg;C for up to a month.</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>IgG (H+L) Antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting media with DAPI</td><td>Vector&lt;br/&gt; Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Plastic slide box</td><td>Fisher</td><td>03-448-1</td><td>Store slides containing dried spreads in slots at -20&amp;deg;C. Also, use as a wet chamber.</td></tr><tr><td>Cardboard slide box</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>Fisher</td><td>08-816</td><td>Use as a wash basin for slides.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

L&#39;apparition de germes de propagation dépend de façon critique de l&#39;équilibre entre la fixation du chromosome et de compactage. Même lorsque les réactifs sont correctement équilibrées, la variation dans le degré de compactage de chromosome peut se produire dans différentes régions de la même lame et / ou entre les différentes lames. Ainsi, la qualité des spreads dans une région donnée d&#39;une diapositive devrait être évaluée avant que les images sont interprétées. <p class="jove_content...

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Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Répandre surface et Immunocoloration des chromosomes de levure

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

surface-spreading-and-immunostaining-of-yeast-chromosomes

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Biology

9.9K vues.  University of Chicago. A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

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Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

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Analyse du développement d&#39;un phénotype morphologique en fonction de la concentration de protéines dans la levure bourgeonnante

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Biologie

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have constructed fluorescent protein-based markers for major organelles and endomembrane structures, including the nucleus, endoplasmic reticulum (ER), Golgi apparatus, endosomes, vacuoles, mitochondria, peroxisomes, lipid droplets, and autophagosomes. The protocol presented here describes the procedures for using these markers in yeast, including DNA preparation for yeast transformation, selection and evaluation of transformants, fluorescent microscopic observation, and the expected outcomes. The text is geared toward researchers who are entering the field of yeast organelle study from other backgrounds. Essential steps are covered, as well as technical notes about microscope hardware considerations and several common pitfalls. It provides a starting point for people to observe yeast subcellular entities by live-cell fluorescent microscopy. These tools and methods can be used to identify protein subcellular localization and track organelles of interest in time-lapse imaging.

<meta charset="utf8"></head><body>Visualisation des organites de levure avec des marqueurs protéiques fluorescents

Here we describe the use of a set of fluorescent protein-based organelle markers in live-cell imaging of the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

Visualisation des organites de levure avec des marqueurs protéiques fluorescents

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have ...

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Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

Méthode d&#39;insertion de levure Colony

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Analyse de Microarray pour Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitatives de fluorescence Live Cell-microscopie Analyse de la levure à fission

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

Visualisation de Candida albicans dans le tractus gastro-intestinal murine utilisant l'hybridation fluorescente in Situ

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Immunologie et infection

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Microscopie de levure Fission Lifecycle sexuelle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Examen de la dynamique nucléaire de levure de fission mitotique et méiotique par fluorescence Microscopie à cellules vivantes

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Répandre surface et Immunocoloration des chromosomes de levure

Résumé

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Analyse du développement d'un phénotype morphologique en fonction de la concentration de protéines dans la levure bourgeonnante

Visualisation des organites de levure avec des marqueurs protéiques fluorescents

Visualisation des organites de levure avec des marqueurs protéiques fluorescents

Méthode d'insertion de levure Colony

Analyse de Microarray pour Saccharomyces cerevisiae

Quantitatives de fluorescence Live Cell-microscopie Analyse de la levure à fission

Visualisation de Candida albicans dans le tractus gastro-intestinal murine utilisant l'hybridation fluorescente in Situ

Visualisation et d'analyse de molécules d'ARNm par fluorescence

Microscopie de levure Fission Lifecycle sexuelle

Examen de la dynamique nucléaire de levure de fission mitotique et méiotique par fluorescence Microscopie à cellules vivantes