Ce travail est financé par une bourse de chercheur ERC avancée de l&#39;AMA (DAT, TB) avec une contribution d&#39;une subvention de projet du Wellcome Trust à l&#39;AMA, une bourse d&#39;études à l&#39;EPSRC PB-J et Erasmus, Stichting dr. Vaderlandsch Fonds de Hendrik Muller et Fundatie van de Vrijvrouwe van Renswoude &#39;te&#39; s-Gravenhage à SCvdB. Nous tenons à remercier J. Briscoe, S. Muñoz-Descalzo, C. Schroeter, et T. Rodriguez, de discussions et de critiques constructives, Joaquin de Navascués pour le protocole milieu de montage et les deux AK Hadjantonakis et C. Budjan pour partager les protocoles de leur laboratoire relatif à la coloration des embryons entiers de montage. Une version antérieure de cet article a déjà été mis à disposition sur le serveur bioRxiv impriment 29.

1. Conditions de culture avant l&#39;agrégation <ol><li> Maintenir mESCs en milieu ESLIF (voir le tableau des matériaux et des équipements spécifiques pour la formulation) sur 2 de culture de tissus traités flacons revêtues de gélatine 25 cm dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 21 au 25 fév. </li><li> Cultiver les cellules pendant au moins deux passages poster décongélation avant utilisation dans ce protocole; cellules à des passages inférieurs sont généralement plus réussi à générer des caractéristiques reproductibles tout au long de répétitions expérimentales (ie., pas plus de 15 passages en culture), mais légère variation entre les différentes cellules ES lignes est à prévoir (voir le tableau 2 pour les lignées cellulaires testées ). </li><li> Cultiver les cellules à 40-60% de confluence. Ne pas utiliser sur les cellules confluentes pour l&#39;agrégation. </li></ol> 2. Génération de Granulats <ol><li> Pré-PBS chaud (+ Ca 2+, + Mg 2+), ESLIF, N2B27 26,27 </sup&gt; et de trypsine-EDTA dans un bain d&#39;eau à 37 C °. </li><li> Aspirer le milieu de culture à partir de la fiole de culture de tissu (étape 1.3). Rincer la fiole doucement avec 5 ml de PBS, deux fois. Aspirer le PBS et ajouter 1 à 2 ml de pré-chauffé trypsine-EDTA (0,25%) pour dissocier les cellules. <ol><li> Placer la fiole dans un incubateur à &lt;5 min ou jusqu&#39;à ce que les cellules sont complètement détaché de la surface du ballon. Introduire à la pipette de haut en bas avec une pipette de 1 ml pour produire une suspension à cellule unique pour le comptage précis et la formation de la taille des agrégats uniforme. </li></ol></li><li> Neutraliser la trypsine avec 5-10 ml ESLIF; arroser la surface de croissance afin de maximiser la récupération des cellules et transférer dans un tube de centrifugation de 50 ml. Supprimer un aliquote de 1 ml du tube de centrifugeuse et de compter les cellules avec un hémocytomètre. </li><li> Déterminer le volume de suspension nécessaire pour donner 10 cellules / ul (toute une plaque de 96 puits nécessite 5x10 4 cellules dans une suspension 5 ml). Compter les cellules précision, aussi grand deviatdes ions à partir du nombre de cellules indiqué peuvent affecter la réponse des agrégats à des stimuli. </li><li> Ajouter 5x10 4 cellules à 5 ml de PBS préchauffé dans un 50 ml tube de centrifugeuse frais et de spin à ~ 170 g pendant 5 min. </li><li> Aspirer soigneusement le PBS et ajouter 5 ml préchauffé PBS doucement; Ne pas déranger le culot au fond du tube. Centrifuger à ~ 170 g pendant 5 min. </li><li> Aspirer avec précaution du PBS pendant une deuxième fois. Retirez autant PBS que possible sans perturber le culot que PBS report peut nuire à l&#39;agrégation. Reprendre le culot dans 1 ml d&#39;une part N2B27 chaud avec une pipette P1000 pour produire une suspension cellulaire homogène, suivi par une addition supplémentaire de N2B27 au volume requis (par exemple, ajouter 4 ml de 5x10 4 cellules / ml de suspension 5). </li><li> Transférer la suspension cellulaire à un réservoir stérile et la pipette une gouttelette de 40 ul dans le fond de chaque puits d&#39;une non-culture tissulaire traitée, &#39;U&#39; à fond 96-waune plaque en utilisant une pipette multicanaux. Recouvrir la plaque de 96 puits avec son couvercle correspondant et confirmer la présence de cellules avec un inversé paillasse microscope (figure 1B). Remarque: Il est essentiel que ces plaques sont utilisés pour limiter la possibilité de cellules adhérentes. Ne pas recouvrir le fond de la plaque à 96 puits avec de la gélatine, la fibronectine ou tout autre revêtement qui favorise l&#39;adhésion cellulaire. </li><li> Incuber les cellules pendant 48 h dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2 pour l&#39;agrégation. </li></ol> 3. L&#39;application de stimuli et de changement de support <ol><li> Après la période d&#39;incubation de 48 h, observer l&#39;apparition des mESCs dans chaque puits de la plaque de 96 puits pour confirmer l&#39;agrégation succès (figure 1E). Remarque: Granulats apparaîtront sphérique dans la nature et environ 150-200 m de diamètre. Reportez-vous à la section de dépannage en cas de problèmes (tableau 1). </li><li>0; 150 Ajouter moyen secondaire ul frais (3 uM Chi99021 (Chi) dans N2B27 19; mère préparée à 10 mM dans DMSO) à chaque puits à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux. Introduire à la pipette avec une force suffisante pour déloger les agrégats qui peuvent avoir commencé à adhérer au fond des puits. Incuber les granulats au moyen secondaire pendant 24 heures dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2 (figure 1A). Remarque: agrégats allongés et polarisées reproductibles sont générées en utilisant ce moyen secondaire. D&#39;autres compositions de fluide secondaire peuvent également être utilisés en fonction des conditions expérimentales requises et des exemples sont présentées dans la figure 3. </li><li> Pour les modifications ultérieures moyennes, utiliser une pipette multicanaux tenue à un angle (environ 30 °) pour enlever délicatement 150 pi du milieu secondaire du côté de chaque puits. Ensuite, pipette 150 pi frais N2B27 dans chaque puits avec suffisamment de force pour déloger les agrégats qui peuvent avoir démarrageed pour adhérer au fond des puits. </li><li> Répétez le point 3. 3 tous les 24 heures jusqu&#39;à ce que le temps bien sûr est terminée (la durée typique d&#39;une expérience de culture globale est de 120 h). REMARQUE: Assurez-agrégats se déplacent librement la suite de changements à moyen terme pour assurer la reproductibilité et la cohérence au sein et entre chaque plaque de 96 puits. Moyenne doit être changé tous les jours suivant la période de l&#39;agrégation. </li></ol> 4. Préparation des agrégats pour Immunocoloration et analyse par microscopie confocale <ol><li> Fixation et Anticorps primaire Incubation Remarque: Le protocole décrit par AK Hadjantonakis 28 a été modifié pour convenir à un marquage de MESC agrégats. Pour les anticorps typiques utilisés dans nos études et leurs dilutions, reportez-vous à déjà publié des travaux 19,21,24,25,29 et le Tableau 3. <ol><li> Utilisez une pipette multicanaux tenue à un angle (environ 30 °) pour enlever délicatement moyen de 150 pi du côté of chaque puits de la plaque de 96 puits. Laver deux fois par pipetage 150 ul de PBS dans chaque puits. Laisser un couple de minutes entre chaque lavage pour permettre aux agrégats de se déposer. </li><li> Définir une pipette P1000 pour distribuer 200 pi, fixer la pointe de la pipette correspondante et couper environ 3 mm de l&#39;extrémité de la pointe avec une paire de ciseaux stériles. Dessinez une partie de la PBS dans chaque puits de la plaque de 96 puits sur une courte distance dans la pointe et de l&#39;expulser pour agiter l&#39;agrégat. </li><li> Utilisez la même pointe de dresser tout le volume intérieur du puits, y compris l&#39;agrégat et la pipette dans un petit (30 mm de diamètre) en verre Drosophila dissection bien. Transférez tous les agrégats de la plaque de 96 puits qui subira régimes de immunocoloration identiques dans la même dissection de verre ainsi. Remarque: Utilisez une nouvelle pointe de pipette de coupe lors du transfert des agrégats de différentes conditions expérimentales pour empêcher le report des agrégats. </li><li> Placez le bien de verre qui contient le aggregates sur un microscope de dissection. Agiter le verre ainsi de forcer les agrégats vers le centre et aspirer PBS d&#39;un côté du puits avec une pipette Pasteur en verre. Utilisez le microscope pour assurer les agrégats ne sont pas aspirés. Laisser un petit volume de PBS dans le puits de verre pour couvrir les agrégats pour les empêcher de se dessécher. </li><li> Ajouter 1 ml de formaldéhyde fraîchement préparée (4%) dissous dans PBS et incuber pendant 2 h à 4 ° C sur un agitateur orbital réglé à une vitesse faible. Attention: Paraformaldéhyde est connu pour être allergéniques, cancérigènes et toxiques. Porter une protection appropriée lors de la manipulation. </li><li> Après la fixation, aspirer la solution de formaldéhyde de la même manière que décrit dans l&#39;article 4. 1. 4 et laver les granulats avec 1 ml de PBS trois fois, 10 min pour à chaque lavage, sur un agitateur orbital réglé à une vitesse faible. </li><li> Aspirer le PBS comme décrit dans la section 4. 1. 4 et effectuer trois autres, à 10 min lavages avec du PBS contenant 10% de sérum fœtal bovin et 0,2% Triton X-100 (PBSFT). Effectuez les 10 min lavages sur un agitateur orbital réglé à une vitesse faible. Remarque: L&#39;utilisation de sérum bovin fœtal (FBS) les résultats dans un tampon de lavage clair, réduire le nombre d&#39;agrégats qui autrement seraient perdus durant le protocole si le lait a été utilisé. Il est important de noter qu&#39;à la suite de la fixation, des procédures immunohistochimiques peuvent être effectuées de diverses manières autres que celles décrites ci-dessous et doivent être déterminées et optimisées par l&#39;investigateur. </li><li> Bloquer les agrégats pendant 1 h à 4 ° C dans PBSFT sur un rocker orbitale réglé à une vitesse faible. Le protocole peut être mis en pause à ce point, et les agrégats bloqué O / N, sous agitation constante sur une bascule giratoire horizontale à 4 ° C. </li><li> Aspirer le PBSFT comme décrit précédemment (voir la section 4. 1. 4) et incuber les agrégats avec 500 pi de l&#39;anticorps primaire nécessaire dilué dans PBSFT O / N à 4 ° C sur un agitateur orbital réglé à basse vitesse. Couvrir avec un film de paraffine pour éviter l&#39;évaporation. </li></ol></li><li> L&#39;incubation d&#39;anticorps secondaire <ol><li> Aspirer la solution d&#39;anticorps primaire et on lave avec 1 ml PBSFT (à 4 ° C) de la manière suivante: deux fois pendant 5 min; trois fois pendant 15 min; et quatre à sept fois pendant 1 heure. Effectuez chaque étape de lavage à 4 ° C et sur un rocker orbitale réglé à basse vitesse. Remarque: Réfrigérer milieu de lavage avant de les utiliser. Ne pas effectuer les lavages sur la glace car cela peut causer des agrégats à se fragmenter. </li><li> Aspirer le milieu de lavage final et incuber les agrégats avec l&#39;anticorps secondaire requis dans 500 ul PBSFT O / N à 4 ° C dans l&#39;obscurité sur une bascule giratoire horizontale. Ajouter colorant nucléaire comme Hoechst si nécessaire. </li></ol></li><li> Montage et imagerie par microscopie confocale <ol><li> Laver les agrégats comme décrit dans la section 4. 1. 4 avec 4 ° C PBSFT. Après le lavage final, les agrégats rinçage avec 1 ml de PBS contenant 0,2% de FBS et de Triton X-100 (PBT) de la manière suivante: deux fois pendant 5 min; trois fois pendant 15 minutes. Effectuer lavagesà température ambiante sur un rocker orbitale abri de la lumière. </li><li> Aspirer le milieu comme décrit précédemment (section 1. 4. 4) et incuber pendant 30 min dans l&#39;obscurité avec une solution 1: 1 de glycérol: PBT (1 ml) suivie d&#39;une seconde incubation de 30 min avec un 7: 3 de solution glycérol: PBT (1 ml). Remarque: Mélanger le glycérol et PBT solutions à 4 ° C en utilisant un rotateur. </li><li> Aspirer le glycérol final: solution PBT et remplacer par 1 ml de milieu de montage 24. Le protocole peut être mis en pause à ce point avant le montage (si pause, sceller les puits avec un film de paraffine et de stocker les puits de coloration à 4 ° C). </li><li> Montez les agrégats sur des lames de microscope par eux pipetage dans 17 gouttes ul avec une pointe de P20 de coupe (Figure 2). Pliez ruban adhésif double face sur elle-même quatre fois pour générer des entretoises et joindre à chaque extrémité de la glissière. Placer la lamelle supérieure (22 mm x 60 mm) sur ces entretoises (Figure 2). Remarque: il est essentiel que d&#39;une pointe de coupe estutilisé à ce stade afin de ne pas endommager les échantillons. Les espaceurs empêchent la lamelle de broyage des agrégats. </li><li> Une fois que les agrégats sont montés, les échantillons d&#39;image à l&#39;aide de la microscopie confocale en utilisant des protocoles précédemment décrits 19,21,24,25. Une fois placé sur le microscope, laisser la diapositive non perturbée sur la scène pendant quelques minutes pour permettre aux agrégats de régler au sein du milieu de montage. </li></ol></li></ol>

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	<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc. Natl Acad. Sci. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li><li>Ramkumar, N., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+mouse+primitive+streak.">SnapShot: mouse primitive streak.</a> Cell. 146 (3), 488-488.e2 (2011).</li><li>Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation:+making+and+shaping+germ+layers.">Gastrulation: making and shaping germ layers.</a> Annu Rev. Cell Dev. Biol. 28, 687-717 (2012).</li><li>Tam, P. P. L., Gad, J. M., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+16:+Gastrulation+in+the+Mouse+Embryo.">Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo.</a> Gastrulation: From Cells to Embryo. , 233-262 (2004).</li><li>Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Oct4+expression+during+the+development+of+murine+embryoid+bodies.">Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies.</a> Dev. Biol. 371 (2), 170-179 (2012).</li><li>ten Berge, D., Koole, W., Fuerer, C., Fish, M., Eroglu, E., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+Mediates+Self-Organization+and+Axis+Formation+in+Embryoid+Bodies.">Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).</li><li>Nostro, M. C., Cheng, X., Keller, G. M., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt,+Activin,+and+BMP+Signaling+Regulate+Distinct+Stages+in+the+Developmental+Pathway+from+Embryonic+Stem+Cells+to+Blood.">Wnt, Activin, and BMP Signaling Regulate Distinct Stages in the Developmental Pathway from Embryonic Stem Cells to Blood.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 60-71 (2008).</li><li>Irie, N., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX17+Is+a+Critical+Specifier+of+Human+Primordial+Germ+Cell+Fate.">SOX17 Is a Critical Specifier of Human Primordial Germ Cell Fate.</a> Cell. 160, 1-16 (2015).</li><li>Leahy, A., Xiong, J. W., Kuhnert, F., Stuhlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+developmental+marker+genes+to+define+temporal+and+spatial+patterns+of+differentiation+during+embryoid+body+formation.">Use of developmental marker genes to define temporal and spatial patterns of differentiation during embryoid body formation.</a> J. Exp. Zool. 284 (1), 67-81 (1999).</li><li>Eiraku, M., Takata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Koehler, K. R., Hashino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+mouse+embryonic+stem+cell+culture+for+generating+inner+ear+organoids.">3D mouse embryonic stem cell culture for generating inner ear organoids.</a> Nat. Protoc. 9 (6), 1229-1244 (2014).</li><li>Lancaster, M. A., Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Marikawa, Y., Tamashiro, D. A. A., Fujita, T. C., Alarcon, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+P19+mouse+embryonal+carcinoma+cells+as+a+simple+in+vitro+model+to+study+the+molecular+regulations+of+mesoderm+formation+and+axial+elongation+morphogenesis.">Aggregated P19 mouse embryonal carcinoma cells as a simple in vitro model to study the molecular regulations of mesoderm formation and axial elongation morphogenesis.</a> Genesis. 47 (2), 93-106 (2000).</li><li>Keller, R., Danilchik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+expression,+pattern+and+timing+of+convergence+and+extension+during+gastrulation+of+Xenopus+laevis.">Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis.</a> Development. 103 (1), 193-209 (1988).</li><li>Ishihara, K., Tonegawa, Y., Suyemitsu, T., Kubo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blastocoelic+fluid+of+sea+urchin+embryo+induces+exogastrulation.">The blastocoelic fluid of sea urchin embryo induces exogastrulation.</a> J. Exp. Zool. 220 (2), 227-233 (1982).</li><li>Horstadius, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanisms+of+Sea+Urchin+Development,+Studied+by+Operative+Methods.">The Mechanisms of Sea Urchin Development, Studied by Operative Methods.</a> Bio. Rev. 14 (2), 132-179 (1939).</li><li>Holtfreter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+totale+Exogastrulation,+eine+Selbstabl&#246;sung+des+Ektoderms+vom+Entomesoderm.">Die totale Exogastrulation, eine Selbstabl&#246;sung des Ektoderms vom Entomesoderm.</a> Wilhelm Roux'Archiv f&#252;r Entwicklungsmechanik der Organismen. 129 (4), 669-793 (1933).</li><li>van den Brink, S. C., Baillie-Johnson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+breaking,+germ+layer+specification+and+axial+organization+in+aggregates+of+mouse+ES+cells.">Symmetry breaking, germ layer specification and axial organization in aggregates of mouse ES cells.</a> Development. 141 (22), (2014).</li><li>Eiraku, M., Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals.">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).</li><li>Turner, D. A., Hayward, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/&#946;-catenin+and+FGF+signaling+direct+the+specification+and+elongation+of+a+neural+axial+progenitor+in+ensembles+of+mouse+ES+cells.">Wnt/&#946;-catenin and FGF signaling direct the specification and elongation of a neural axial progenitor in ensembles of mouse ES cells.</a> Development. 141 (22), (2014).</li><li>Faunes, F., Hayward, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+membrane-associated+&#946;-catenin/Oct4+complex+correlates+with+ground-state+pluripotency+in+mouse+embryonic+stem+cells.">A membrane-associated &#946;-catenin/Oct4 complex correlates with ground-state pluripotency in mouse embryonic stem cells.</a> Development. 140 (6), 1171-1183 (2013).</li><li>Kalmar, T., Lim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+Fluctuations+in+Nanog+Expression+Mediate+Cell+Fate+Decisions+in+Embryonic+Stem+Cells.">Regulated Fluctuations in Nanog Expression Mediate Cell Fate Decisions in Embryonic Stem Cells.</a> PLoS Biol. 7 (7), e1000149 (2009).</li><li>Turner, D. A., Trott, J., Hayward, P., Ru&#233;, P., Martinez Arias, ., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interplay+between+extracellular+signalling+and+the+dynamics+of+the+exit+from+pluripotency+drives+cell+fate+decisions+in+mouse+ES+cells.">An interplay between extracellular signalling and the dynamics of the exit from pluripotency drives cell fate decisions in mouse ES cells.</a> Biol. Open. 3 (7), 614-626 (2014).</li><li>Turner, D. A., Ru&#233;, P., Mackenzie, J. P., Davies, E., Martinez Arias, ., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brachyury+cooperates+with+Wnt/&#946;-Catenin+signalling+to+elicit+Primitive+Streak+like+behaviour+in+differentiating+mouse+ES+cells.">Brachyury cooperates with Wnt/&#946;-Catenin signalling to elicit Primitive Streak like behaviour in differentiating mouse ES cells.</a> BMC Biol. 12 (1), 63 (2014).</li><li>Ying, Q. -. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation.">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li><li>Ying, Q. -. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+neuroectodermal+precursors+in+adherent+monoculture.">Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.</a> Nat. Biotechnol. 21 (2), 183-186 (2003).</li><li>Rivera-Perez, J. A., Hadjantonakis, A. -. K., Johnson, R., Sun, X., Escalante-Alcalde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Embryology of the Mouse. , 1-90 (2011).</li><li>Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, ., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Aggregates+of+Mouse+ES+Cells+that+Show+Symmetry+Breaking,+Polarisation+and+Emergent+Collective+Behaviour+in+vitro.">Generation of Aggregates of Mouse ES Cells that Show Symmetry Breaking, Polarisation and Emergent Collective Behaviour in vitro.</a> bioRxiv. , (2014).</li><li>Fehling, H. J., Lacaud, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+mesoderm+induction+and+its+specification+to+the+hemangioblast+during+embryonic+stem+cell+differentiation.">Tracking mesoderm induction and its specification to the hemangioblast during embryonic stem cell differentiation.</a> Development. 130 (17), 4217-4227 (2003).</li><li>Ring, D. B., Johnson, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Glycogen+Synthase+Kinase+3+Inhibitors+Potentiate+Insulin+Activation+of+Glucose+Transport+and+Utilization+In+Vitro+and+In+Vivo.">Selective Glycogen Synthase Kinase 3 Inhibitors Potentiate Insulin Activation of Glucose Transport and Utilization In Vitro and In Vivo.</a> Diabetes. 52 (3), 588-595 (2003).</li><li>Inman, G. J., Nicol&#225;s, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SB-431542+is+a+potent+and+specific+inhibitor+of+transforming+growth+factor-beta+superfamily+type+I+activin+receptor-like+kinase+(ALK)+receptors+ALK4,+ALK5,+and+ALK7.">SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-beta superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7.</a> Mol Pharmacol. 62 (1), 65-74 (2002).</li><li>Hao, J., Daleo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsomorphin,+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+BMP+signaling,+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells.">Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> PLoS ONE. 3 (8), e2904 (2008).</li><li>Neely, M. D., Litt, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMH1,+a+highly+selective+small+molecule+BMP+inhibitor+promotes+neurogenesis+of+hiPSCs:+comparison+of+PAX6+and+SOX1+expression+during+neural+induction.">DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction.</a> ACS Chem. Neurosci. 3 (6), 482-491 (2012).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Niakan, K. K., Ji, H., Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12+Sox17+promotes+differentiation+in+mouse+embryonic+stem+cells+by+directly+regulating+extraembryonic+gene+expression+and+indirectly+antagonizing+self-renewal.">12 Sox17 promotes differentiation in mouse embryonic stem cells by directly regulating extraembryonic gene expression and indirectly antagonizing self-renewal.</a> Genes Dev. 24 (3), 312-326 (2010).</li><li>Chambers, I., Silva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development.">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).</li><li>Rhee, J. M., Pirity, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+imaging+and+differential+localization+of+lipid-modified+GFP-variant+fusions+in+embryonic+stem+cells+and+mice.">et al. In vivo imaging and differential localization of lipid-modified GFP-variant fusions in embryonic stem cells and mice.</a> Genesis. 44 (4), 202-218 (2006).</li><li>Serup, P., Gustavsen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+promoter+substitutions+generating+transcriptional+sentinels+of+diverse+signaling+pathways+in+embryonic+stem+cells+and+mice.">Partial promoter substitutions generating transcriptional sentinels of diverse signaling pathways in embryonic stem cells and mice.</a> Dis. Models Mech. 5 (6), 956-966 (2012).</li><li>Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S., Monk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPRT-deficient+(Lesch-Nyhan)+mouse+embryos+derived+from+germline+colonization+by+cultured+cells.">HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells.</a> Nature. 326 (6110), 292-295 (1987).</li><li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells.">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nature Chemical Biology. 11 (8), 847-854 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Fertilisation and Embryology ACT 2008 - Elizabeth II. , (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

La technique décrite dans ce manuscrit de manière efficace et reproductible génère des agrégats de cellules embryonnaires de souris de troncs (mESCs) qui affichent organisée briser la symétrie et l&#39;allongement 19, combinant à la fois la culture de la goutte suspendue décrite par Marikawa et al. 14 et EB formation. Ces agrégats vont développer des allongements axiaux, compléter les méthodes existantes pour la production d&#39;organes antérieures à partir de cellules ES tels que des tasses optique 11 et le cortex cérébral 13, et contiennent des cellules aux identités des couches trois germinales qui affichent des procédés similaires à ceux au cours de la gastrulation tels que 19,21 rapide de mouvement cellulaire. Il est intéressant de spéculer sur la nature de l&#39;événement de briser la symétrie, car il se produit en l&#39;absence de tissus de motifs externes et l&#39;asymétrie zygotic cues 19. La formation spontanée d&#39;un axe rudimentaire pourrait découler de pré-existante heterogeneities dans la culture à partir de cellules qui forment la base pour le développement de l&#39;asymétrie. En effet, les populations de cellules cultivées dans des conditions ESLIF affichent un mélange d&#39;auto-renouvellement et de différenciation des cellules, les proportions relatives de qui peuvent varier d&#39;un agrégat à l&#39;autre. En outre, des travaux préliminaires dans notre laboratoire suggèrent que les agrégats provenant d&#39;une population de cellules pluripotentes entièrement montrent un retard de développement et les défauts dans la structuration, suggérant un rôle de l&#39;hétérogénéité dans la formation de modèle organisé (DA Turner &amp; A. Martinez Arias, en préparation). Il est également intéressant de considérer que un mécanisme de réaction-diffusion peut générer le modèle, avec un inhibiteur de diffusion opposé de la surface de l&#39;agrégat. Warmflash et al., 41 suggèrent qu&#39;un tel mécanisme pourrait être responsable de l&#39;élaboration asymétrie radiale dans la culture adhérent, ce qui en fait un candidat possible pour la structuration en trois dimensions. Au cours de l &#39;initiativel 48 h période de globalisation, les cellules atteindre un état ​​semblable à celui au sein de l&#39;épiblaste après l&#39;implantation, dans lequel ils sont compétents pour répondre aux signaux du milieu secondaire 19,21,24. Typiquement, le protocole décrit ici fournit des cellules à une impulsion de fluide secondaire qui contient des facteurs (tels que des agonistes Wnt / β-caténine) qui fournissent les signaux nécessaires pour l&#39;allongement. Des méthodes de culture antérieures décrites par Lancaster et al. (À l&#39;aide CES de l&#39;homme 13) et Eiraku et al (avec mESCs 11). A utilisé une courte période de l&#39;agrégation en faible adhérence plaques à 96 puits avant que les cellules agrégées ont été transférés à des gouttelettes Matrigel pour ON- la culture va. Bien que le temps entre l&#39;insertion et l&#39;agrégation Matrigel était différent entre les études, dans les deux cas, un grand nombre de cellules ont été utilisées pour la formation d&#39;agrégats (environ 3,000-4,500 cellules). En revanche, le protocole décrit ici 19 utilise beaucoup moins de cellules (environ 400 cellulespar agrégat) qui a été déterminée comme étant absolument essentiel pour le processus d&#39;allongement, briser la symétrie et la polarisation qui est observé 19. En outre, ces structures allongées sont capables d&#39;être générés dans un temps beaucoup plus courte période sans incorporation dans des matrices artificielles: comparer la génération de régions cérébrales définies par Lancaster et al (&gt; 20-30 jours) 13 et l&#39;optique de tasses Eiraku. et al. (~ 11 jours) 11 avec les 5 jours nécessaires à la génération de structures allongées polarisés. Une des limites avec la méthode de culture décrit ici cependant, est qu&#39;ils ne peuvent être cultivées pendant environ 5-6 jours après placage jusqu&#39;à ce que leur taille les rend compétente en vertu de la gravité pour couler au fond des puits et forcer une adhérence même sur non plastique-ware revêtu de. D&#39;autres expériences utilisant des matrices artificielles telles que celles mentionnées précédemment, peuvent nous permettre d&#39;augmenter la période deobservation et l&#39;expérimentation, et des travaux sont en cours pour déterminer les effets de contraindre les agrégats de telle manière. Une autre limite de cette technique est que, afin de changer le milieu sans enlever les agrégats, un petit volume de milieu doit être laissé dans le fond du puits. Les conséquences pour la génétique chimique approches sont la nécessité d&#39;examiner cette dilution et les effets résiduels de multimédia précédent: le jour de l&#39;3uM Chi impulsion, 2,37 uM solution est effectivement livrée, et les variations moyennes suivantes entraîner un report de 0,499 iM (72-96 h) et 0,105 uM (96-120 h) entre les points de temps. Les travaux en cours n&#39;a pas corrigé pour la dilution et il est supposé que les changements moyennes quotidiennes de minimiser les effets résiduels. Il ya un certain nombre d&#39;étapes critiques dans le protocole pour assurer la reproductibilité intra- et inter-expérimentale. Tout d&#39;abord, la culture de départ de mESCs doit être bien entretenu et pas trop confluent, et moyen doivent toujours être bon-à-dire de la qualité., frais et bien mixte (figure 5A, B). Conditions de culture défavorables affectent négativement l&#39;agrégation (Figure 5BI). Comptage précis des cellules pour obtenir une suspension de cellules ~ 400 cellules / 40 ul est essentiel, que les grands agrégats ne parviennent pas à l&#39;auto-organisation et sont plus susceptibles de former des agrégats doubles dans chaque puits (Figure 5Bii) tandis que les petits agrégats sont incapables de parvenir à la bonne densité où ils sont en mesure de répondre à la relance (Figure 5Biii). Une étape d&#39;optimisation clé était l&#39;inclusion d&#39;un second lavage PBS qui élimine le sérum contaminant de la suspension de cellules (étape 2.6); cette amélioration de la fréquence de l&#39;agrégation et a accéléré le développement des agrégats d&#39;environ 24 heures. Ensuite, en assurant à moyen modifications sont appliquées avec une force suffisante pour déloger les agrégats qui ont le potentiel d&#39;adhérer à la surface du puits; défaut de le faire resuLTS dans le fracas de &#39;les agrégats (Figure 5Biv). En outre, et comme mentionné précédemment (et ci-dessous), il est indispensable de veiller à ce que les agrégats sont maintenues en culture en suspension et sont empêchées d&#39;adhérer à toutes les surfaces. Une fois que les agrégats ont adhéré, le profil d&#39;expression des gènes et leur potentiel d&#39;allongement sont perturbés. Comme cette technique est relativement simple, et bien de la compétence des individus avec de bonnes techniques de culture de tissus, la plupart des problèmes liés à l&#39;agrégation peut être résolu assez rapidement si ces étapes critiques sont suivies; une table pleine de dépannage est disponible (tableau 1). Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour étudier le développement axial, brisure de symétrie et de la cellule-décision événements. Plus précisément, ces agrégats ont le potentiel de générer des pools de cellules qui ont été jusqu&#39;à présent pas disponible dans la culture, tels que la moelle épinière et motoneurones r. Remarque éthique: Il convient de noter avec prudence que la traduction de ce protocole d&#39;ES humaines ou culture de cellules iPS pourrait amener l&#39;expérimentateur à proximité de la base juridique de la limite de quatorze jours sur la recherche sur l&#39;embryon humain, à savoir la génération d&#39;une ligne primitive, comme détaillé dans la loi sur les droits Fertilisation and Embryology 2008 (Royaume-Uni) 42. Depuis la loi couvre tous les embryons humains vivants quel que soit leur mode de création, de la culture des droits de gastruloids-delà de la primitive-série comme étape serait au-delà de la portée de la recherche sous licence.

L&#39;étude et la compréhension des décisions destins cellulaires dans le développement des mammifères précoce peuvent faire usage de cultures de cellules souches embryonnaires (CSE), les populations clonales dérivées à partir de blastocystes qui ont la capacité d&#39;auto renouveler et se différencier en tous les types d&#39;un organisme de cellules-à-dire., ils sont le 1,2 pluripotent. Bien que ces cultures ont été et continuent d&#39;être utile pour la compréhension de la base moléculaire de décisions destins cellulaires, ils sont incapables de reproduire certaines des dispositions spatiales et des comportements globaux qui sont générés dans les embryons pendant la gastrulation. Dans l&#39;embryon, le processus de gastrulation transforme une couche épithéliale unique dans les trois couches germinales distinctes et dote l&#39;embryon avec une organisation antéro-postérieur manifeste 3-5. Les tentatives de récapituler ces événements ex vivo ont été basées sur la génération d&#39;agrégats tridimensionnels de CES, appelés corps comme embryoïdes (EBS), et en les soumettant to 6,7 conditions de différenciation. Ces agrégats peuvent être amenées à se différencier en de nombreux types cellulaires différents, dont certains sont incapables d&#39;obtenir ou induite par une faible efficacité dans la culture adhérente ou non peut être produit à tous;. Par exemple, le sang 8 et germinales primordiales cellules 9. Toutefois, une limitation de l&#39;utilisation de ballasts électroniques est qu&#39;ils sont incapables d&#39;afficher le comportement morphogénétique, la distribution de la couche de germe ou une organisation axiale qui sont caractéristiques majeures du développement de l&#39;embryon, ce qui entraîne la désorganisation spatiale 6,10. Dans un rapport, le traitement d&#39;EBS avec Wnt conduit à une polarisation faible dans l&#39;expression des gènes dans certains agrégats mais pas de la morphogenèse claire est observée 7. Dans les rapports les plus récents, EBS qui ont été cultivées pendant des périodes de temps prolongées développent des structures antérieures telles que la rétine, le cortex et les cellules sensorielles de l&#39;oreille interne, qui imitent leurs homologues embryonnaires, mais se développent sans le contexte d&#39;un organis axialeion 11-13. Un rapport de Marikawa et al. 14, tout en travaillant avec des agrégats de P19 embryon de souris Carcinome (CE) cellules formées par la méthode goutte suspendue, a rapporté l&#39;émergence de structures allongées d&#39;origine mésodermique qui rappelle les allongements qui sont observés avec exogastrulae dans amphibien et les embryons d&#39;oursins et Keller explants 15-18. Comme cela n&#39;a pas été observé avec la souris cellules souches embryonnaires (de mESCs), nous avons tenté de reproduire le comportement observé avec P19 cellules CE utilisant des agrégats de mESCs 19 et nous présentons des conditions de culture qui conduisent à leur brisure de symétrie et l&#39;allongement axial. Une différence importante du travail avec des cellules de P19 est que le protocole d&#39;agrégation décrit ici est réalisée dans une plaque à 96 puits, analogue à celle décrite par Eiraku et al. 20, au lieu de gouttes de suspension. Ce changement a entraîné une plus grande efficacité en termes de récupération globale et à la foisreproductibilité intra et inter-expérimentale. Surtout, le maintien de granulats dans les puits individuels assure que la fusion entre les agrégats (commune où la mise en commun des agrégats de gouttes suspendues) ne se produit pas. En outre, un élément clé du protocole est une exposition de 24 h à l&#39;CHI99021 inhibiteur de GSK3 (Chi), un puissant activateur de la signalisation Wnt / β-caténine, après agrégation. La méthode décrite ici fournit une base pour la compréhension des processus d&#39;auto-organisation, l&#39;organisation axiale et la spécification de la couche de germe dans la culture, ce qui permet de faire des inférences concernant le développement axiale in vivo 19,21. Pour ces raisons, la méthode a le potentiel de permettre une analyse mécanistique détaillée des processus qui peuvent être difficiles à étudier chez l&#39;embryon. En outre, une application potentielle est dans la production de tissus et d&#39;organes qui ne sont pas faciles à obtenir dans la culture adhérent en raison de l&#39;absence d&#39;une niche cellulaire structuré tel que21 précurseurs de la moelle épinière et les neurones moteurs. La culture globale tridimensionnelle offre une structure physique et de l&#39;environnement de signalisation qui peuvent ne pas être réalisable par des moyens classiques, conduisant à une nouvelle approche pour la dérivation de lignées embryonnaires d&#39;une manière spatialement organisé.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:116px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">31350-010</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:235px;">25cm2 Cell Culture Flask</td>
			<td style="width:116px;">Grenier Bio-one</td>
			<td style="width:87px;">690 175</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Benchtop Centrifuge</td>
			<td style="width:116px;">MSE</td>
			<td style="width:87px;">MSB020.CX1.5</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="89">
			<td height="89" style="height:89px;width:235px;">BES Buffered Saline (BBS)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">B2891</td>
			<td style="width:188px;">BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Centrifuge tubes (15 or 50ml)</td>
			<td style="width:116px;">Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td style="width:87px;">118271 or 227261</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:235px;">CHIR 99021 (Chi)</td>
			<td style="width:116px;">CSCR</td>
			<td style="width:87px;">n/a</td>
			<td style="width:188px;">Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Dissection Well (30mm Internal Diameter)</td>
			<td style="width:116px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:87px;">12678586</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:235px;">ESLIF</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:188px;">500 mL GMEM, 5mL Sodium Pyruvate, 5 mL Non-Essential Amino Acids, 5 mL Glutamax, 1 mL beta-mercaptoethanol, 50 mL FBS and 550 &#181;L LIF (1000 units).</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:116px;">Biosera</td>
			<td style="width:87px;">FB-1090/500</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:235px;">Gelatin</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">G1890-100G</td>
			<td style="width:188px;">Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use.</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Glasgow&#39;s Minimal Essential Medium (GMEM)</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:87px;">11710-035</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:87px;">35050-038</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Glycerol</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">G5516</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Improved Neubauer Haemocytometer</td>
			<td style="width:116px;">Hawksley</td>
			<td style="width:87px;">AS1000</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:235px;">Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant</td>
			<td style="width:116px;">CSCR</td>
			<td style="width:87px;">n/a</td>
			<td style="width:188px;">Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">n-Propyl-gallate</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">02370</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:235px;">N2B27/NDiff 227</td>
			<td style="width:116px;">Stemcells, Inc.</td>
			<td style="width:87px;">SCS-SF-NB-02</td>
			<td style="width:188px;"><a href="http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff">http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff</a></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:116px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">11140-035</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:235px;">Paraformaldehyde powder</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">P6148</td>
			<td style="width:188px;">Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">D8662</td>
			<td style="width:188px;">With Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">11360-039</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Sterile Reservoir</td>
			<td style="width:116px;">STARLAB</td>
			<td style="width:87px;">E2310-1010</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate</td>
			<td style="width:116px;">Grenier Bio-one</td>
			<td style="width:87px;">650185</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">X100</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:87px;">25300-054</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro

Nous avons développé un protocole amélioration de la culture actuelle embryoïde corps (EB), qui permet l&#39;étude de l&#39;auto-organisation, la brisure de symétrie, l&#39;allongement axial et la spécification du destin cellulaire utilisant des agrégats de souris des cellules souches embryonnaires (mESCs) en culture en suspension. Un petit nombre de mESCs sont agrégées en milieu de base pendant 48 heures dans la non-culture de tissus traités, U-fond plaques à 96 puits, après quoi ils sont compétents pour répondre aux signaux expérimentaux. Après le traitement, ces agrégats commencent à montrer des signes de l&#39;expression des gènes et de modifier progressivement polarisé leur morphologie à partir d&#39;une masse sphérique de cellules à une structure allongée, bien organisé en l&#39;absence d&#39;indices d&#39;asymétrie externes. Ces structures ne sont pas seulement capable d&#39;afficher des marqueurs des trois feuillets embryonnaires, mais affichent activement les mouvements de gastrulation-like, matérialisés par un délogement directionnelle des cellules individuelles de l&#39;ensemble, qui se produit à une région cruciale de la structure allongée. Cette protocol fournit une méthode détaillée pour la formation reproductible de ces agrégats, leur stimulation avec des signaux tels que l&#39;activation Wnt / β-caténine et l&#39;inhibition BMP et leur analyse par simple point de temps ou time-lapse microscopie fluorescente. En outre, nous décrivons des modifications aux procédures embryon de coloration actuels toute la montagne-souris pour l&#39;analyse immunocytochimique de marqueurs spécifiques au sein des agrégats fixes. Les modifications de la morphologie, l&#39;expression du gène et la longueur des agrégats peuvent être mesurées quantitativement, fournissant des informations sur la manière dont les signaux peuvent modifier sorts axiales. Il est prévu que ce système peut être appliqué à l&#39;étude des événements précoces de développement tels que le développement axial et l&#39;organisation, et plus largement, les processus d&#39;auto-organisation et de décision cellulaire. Il peut également fournir un créneau adapté pour la génération de types présents dans l&#39;embryon, qui sont impossibles à obtenir à partir de la culture de cellules adhérentes conventionnel tel que la moelle épinière et les neurones moteurs.

Apparence des cellules immédiatement après l&#39;étalement et après agrégation Immédiatement après le placage, on peut observer la présence de cellules uniques dans chaque puits de la plaque de 96 puits avec un écart inversé culture tissulaire microscope (figure 1B). Dans 8 h de placage, ces cellules ont commencé à descendre au fond du puits en raison de la gravité et auront commencé à se regrouper en groupes discrets (figure 1C). Après 24 heures, les cellules de coalescence auront achevé de l&#39;agrégation primaire, et auront compacté dans bien définies, des agrégats encore en lambeaux où les cellules individuelles sont indistincts les uns des autres (figure 1D). À la fin de la deuxième journée (48 h), les agrégats devraient regarder «propre», après avoir pris toutes les cellules dans le puits (figure 1E); le fond du puits peut avoir des cellules qui ont été versées à partir de l&#39;ensemble à ce stade. Fournirque les agrégats ont été agrégées dans N2B27, à ce moment-points, ils devraient être sphérique, d&#39;environ 150-200 m de diamètre et de se déplacer librement dans le puits (ie., pas adhéré au fond des puits). Agrégation dans d&#39;autres médias (ie., ESLIF ou N2B27 avec des facteurs spécifiques) a le potentiel de modifier à la fois la morphologie globale initiale et la réponse à des stimuli ultérieurs (Turner et al., En préparation). Représentant des changements morphologiques Ajout d&#39;une impulsion de 24 heures de milieu secondaire contenant Chi entre 48 et 72 heures (figure 1A, 5A) génère bien défini agrégats allongés qui montrent l&#39;expression polarisée des marqueurs spécifiques des couches germinales 19,21. Immédiatement après l&#39;impulsion Chi (72 h), les agrégats vont commencer à éliminer les cellules et de commencer à montrer leur réponse à ces signaux vers la fin de cette journée (figure 3A). Ces réponsesse manifestent par des changements dans l&#39;expression génique et de la morphologie, les deux étant dépendante de traitement que les agrégats ont reçu après la période de 48 h agrégation initiale dans N2B27 (figure 3B). Si seulement une analyse de point de terminaison est nécessaire, le moment optimal pour l&#39;image des agrégats est à environ 96-120 h. À ce stade, les agrégats auront développé morphologies claires et les profils d&#39;expression génique (figure 3A), et de leur taille et de masse sont encore assez bas pour que l&#39;éjection de milieu de pipette P200 est suffisante pour déloger toutes celles qui pourraient avoir attaché. Le défaut d&#39;empêcher la fixation de l&#39;ensemble au bien nuira à la formation d&#39;agrégats (figure 5Biv). Le motif d&#39;expression génique morphologies et des agrégats peut être modifiée en fonction du traitement. Les résultats représentatifs pour les régimes soutenus ou pulsés avec soit un traitement unique ou combinaisons de facteurs sont présentées pour BMP4, Dorsomorphin H1 (BMP inhibiteur de récepteur), ActivinA, SB43 (activine / inhibiteur Nodal), bFGF ou PD03 (inhibiteur de MEK) (figure 3B). Imagerie globale et Analyse quantitative d&#39;images Granulats se prêtent à l&#39;imagerie par microscopie à champ large soit (principalement pour imagerie time-lapse 19), ou fixe et immunocolorées pour l&#39;imagerie confocale 19,21 (figure 2). Le protocole et l&#39;imagerie description actuelle ci-dessus permet à l&#39;information quantitative à tirer de ces agrégats. Suite à foyer commun ou à grand champ capture d&#39;image, la longueur et l&#39;expression du gène correspondant le long de la colonne vertébrale ou le diamètre de l&#39;agrégat (sphérique ou allongée respectivement; la figure 4A, B) peuvent être mesurés. Ces analyses sont aussi directement applicable aux images time-lapse, où l&#39;on peut obtenir des informations de la vitesse de croissance, la taille et l&#39;allongement des agrégats dans des conditions différentes (Figure 4 </strong&gt;). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig1.jpg" /> Figure 1. typique temps-cours et début des morphologies. (A) Le temps-parcours typique pour des expériences d&#39;agrégation. Les cellules sont agrégées pour 48 h dans N2B27 contenant une suspension de cellules ES de souris (10 cellules / ul) dans une plaque de 96 puits (P1, P2). (B) immédiatement après l&#39;étalement (t = ~ 5min), des cellules individuelles peuvent être vu dans la suspension et ont commencé à former des amas de 8h (C). (D) Après 24 heures les cellules ont formé une seule total dans chaque puits, qui est d&#39;environ 100 um de diamètre. (E) Après l&#39;agrégation de 48 heures, l&#39;ensemble diamètre varie de 150 à 200 um. À ce stade, le moyen d&#39;agrégation (N2B27) est supprimé et un moyen secondaire est ajouté soit pour le reste de l&#39;expérience (p1 dans la partie A) ou pendant 24 heures avant d&#39;être changé bACK à N2B27 (p2 dans la partie A). La barre d&#39;échelle représente 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig2.jpg" /> Figure 2. agrégats montage sur des lames de microscope. Une fois que les agrégats ont été fixés, et immunocolorées placé dans un milieu de montage, chaque ensemble est introduit à la pipette sur une lame de microscope en gouttelettes 17 ul (A, B, B &#39;). Suffisamment d&#39;espace est laissé entre les gouttelettes d&#39;agrégats pour empêcher leur fusion. Entretoises sont fabriqués avec du ruban adhésif double face et placés à chaque coin de la lame de microscope (A, A &#39;, B). Il est sur ​​celles-ci que d&#39;une lamelle de verre est placé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Figure 3. L&#39;effet des différents traitements sur la morphologie des cellules ES agrégées. Suite à 2 jours dans N2B27, les cellules ES ont formé des agrégats. L&#39;addition de facteurs spécifiques soit comme une impulsion de 1 jour (A) ou en continu (B) peut modifier le phénotype d&#39;agrégats par rapport à la polarité de l&#39;expression génique, le potentiel d&#39;allongement, ou leur forme globale. Les exemples dans ce chiffre sont des agrégats formés à partir soit Bra :: GFP 30 (A) ou Sox1 :: GFP cellules ES 27 (B) de souris imagées après 120 h et traités comme indiqué. Chi: CHIR 99021 31; SB43: SB 431542 32; DM: DorsomorphinH1 33,34; PD03:. PD0325901 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de e</a>est la figure. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig4.jpg" /> Figure 4. Analyse quantitative des agrégats. Un agrégat typique formé de Bra :: mESCs GFP 25,30 après une impulsion de 24 h de Chi et imagées à 120 h. Image fusionnée du champ lumineux et le canal GFP est montré avec le marquage «colonne vertébrale» de l&#39;agrégat d&#39;un point A à B (A) courbe segmentée, le long de laquelle la fluorescence et la longueur de l&#39;ensemble peuvent être mesurés (B). La longueur (C) et &quot;rondeur&quot; (D) 24 à partir de granulats au sein de la même expérience sont présentés. Descripteurs de forme telle que la rondeur (D), la circularité, périmètre et la surface peuvent être mesurées en utilisant l&#39;analyse d&#39;images Cookbook plugin à partir de l&#39;analyse d&#39;image logiciel FIDJI 35. Moyenne indiquée par la ligne horizontale à chaque point de temps;les barres d&#39;erreur indiquent l&#39;écart type; barre d&#39;échelle dans (A) indique 200 um. Comme il y a des différences subtiles entre des lignées cellulaires rapporteurs, il est prévu que, après une impulsion de Chi, la longueur maximale moyenne minimum et de la rondeur moyenne des agrégats peuvent varier. Entre les différentes lignées cellulaires, nous constatons que la longueur maximale moyenne peut être dans la gamme de ~ 400-800 um et la rondeur minimale moyenne entre 0,4 et 0,6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig5.jpg" /> Figure 5. Exemples de défaillances dans la formation d&#39;agrégats. La capacité à générer des agrégats reproductibles (A) dépend de facteurs critiques tels que (Bi) de milieu secondaire fraîche et bien mélangé, (Bii, Biii) la précision à compter le n initialombre des cellules et des agents immobiliers (IPI) assurant les agrégats ne forment pas des colonies adhérentes ie., «crash» dans la surface du puits. Des exemples typiques des erreurs dans la formation d&#39;agrégats pour chacune des conditions mentionnées (B) sont représentés. Scale-bar comme indiqué; voir tableau de dépannage pour plus de détails (tableau 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/53252/53252table1.jpg" /> Tableau 1. Guide de dépannage. Erreurs typiques associés avec le protocole d&#39;agrégation sont donnés avec des suggestions quant à leur résolution. <img alt="Tableau 2" src="/files/ftp_upload/53252/53252table2.jpg" /> Tableau 2. Tableau de lignées cellulaires testées pour la formation de aggRégates. Un certain nombre de lignées cellulaires 19,22,27,30,36-40 ont été caractérisés pour la formation d&#39;agrégats et, bien que les différences subtiles entre les lignées cellulaires sont attendus et ont été observés, toutes les lignes ci-dessus montrent une dynamique similaire en termes de l&#39;allongement et de la morphologie. En ce qui concerne l&#39;expression du gène, le modèle d&#39;expression est spécifique du gène exprimé, mais à l&#39;intérieur de chaque lignée cellulaire, le profil d&#39;expression est généralement constante sur un certain nombre de passages. Par souci de cohérence, nous générons des agrégats de cellules qui ont ne dépassent pas 15 passages en culture. <img alt="Tableau 3" src="/files/ftp_upload/53252/53252table3.jpg" /> Tableau 3. Liste des anticorps représentatifs utilisés dans ces études. Une sélection des anticorps et les facteurs de dilution utilisés pour la coloration immunologique globale.

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Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

We have developed a protocol to generate aggregates of mouse embryonic stem cells that display self-organization, symmetry breaking and elongation paralleling axial development. This technique allows the study of axial developmental processes and the generation of cell types that are otherwise difficult to perform in monolayer culture.

Génération d&#39;agrégats de souris de cellules souches embryonnaires qui montrent la brisure de symétrie, la polarisation et le comportement collectif émergent<em&gt; In Vitro</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

17.4K vues.  University of Cambridge. We have developed a protocol to generate aggregates of mouse embryonic stem cells that display self-organization, symmetry breaking and elongation paralleling axial development. This technique allows the study of axial developmental processes and the generation of cell types that are otherwise difficult to perform in monolayer culture.

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Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, they lack hormone responsiveness and the overall procedure is cost-intensive. &#8220;Biological pacemakers&#8221; generated from PSCs may become an alternative, yet the typical content of pacemaker cells in Embryoid Bodies (EBs) is extremely low. The described protocol combines &#8220;forward programming&#8221; of murine PSCs via the sinus node inducer TBX3 with Myh6-promoter based antibiotic selection. This yields cardiomyocyte aggregates consistent of &#62;80% physiologically functional pacemaker cells. These &#8220;induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) are spontaneously contracting at yet unreached frequencies (400-500 bpm) corresponding to nodal cells isolated from mouse hearts and are able to pace murine myocardium ex vivo. Using the described protocol highly pure sinus nodal single cells can be generated which e.g. can be used for in vitro drug testing. Furthermore, the iSABs generated according to this protocol may become a crucial step towards heart tissue engineering.

This protocol describes how to produce functional sinus nodal tissue from murine pluripotent stem cells (PSC). T-Box3 (TBX3) overexpression plus cardiac Myosin-heavy-chain (Myh6) promoter antibiotic selection leads to highly pure pacemaker cell aggregates. These &#8220;Induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) contain over 80% pacemaker cells, show highly increased beating rates and are able to pace myocardium ex vivo.

Génération de stimulateur cardiaque murin agrégats de cellules fondées sur la ES-Cell-programmation en combinaison avec MYH6-promoteur-sélection

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Recherche

Biologie du développement

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Différenciation neurale des souris de cellules souches embryonnaires dans le sérum sans culture monocouche

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

Structure-fonction des études chez la souris à l&#39;aide de cellules souches embryonnaires recombinase médiation cassette d&#39;échange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

In Vitro Croissance des follicules Preantral souris sous microgravité simulée

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

Génération d’insuline exempte d’échafaudage, en trois dimensions exprimant Pancreatoids de souris progéniteurs pancréatique In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Dans Vitro génération du Somite dérivés de Human induit Pluripotent Stem cellules

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro when stem cells are spatially confined onto micropatterns, thus setting up experimental models which offer unique opportunities to identify, in vitro, the fundamental principles of biological organisation.
Here we describe our own implementation of the methodology. We adapted a photo-patterning technique to reduce the need for specialized equipment to make it easier to establish the method in a standard cell biology laboratory. We also developed a free, open-source and easy to install image analysis framework in order to precisely measure the preferential positioning of sub-populations of cells within colonies of standard shapes and sizes. This method makes it possible to reveal the existence of patterning events even in seemingly disorganized populations of cells. The technique provides quantitative insights and can be used to decouple influences of the environment (e.g., physical cues or endogenous signaling), on a given patterning process.

The method presented here uses micropatterning together with quantitative imaging to reveal spatial organization within mammalian cultures. The technique is easy to establish in a standard cell biology laboratory and offers a tractable system to study patterning in vitro.

Cartographier l'organisation spatiale émergente des cellules mammifères à l'aide de micromodèles et d'imagerie quantitative

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

Évaluation des dommages oxydatifs dans les cellules de surface oculaires de la souris primaire/cellules souches en réponse aux dommages causés par les ultraviolets-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

Différenciation et caractérisation des progéniteurs neuronaux et des neurones à partir de cellules souches embryonnaires de souris

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial follicles, the storage unit of the female germline. They are non-renewable, thus their number at birth and subsequent rate of loss largely dictates the female fertile lifespan. Accurate quantification of primordial follicle numbers in women and animals is essential for determining the impact of medicines and toxicants on the ovarian reserve. It is also necessary for evaluating the need for, and success of, existing and emerging fertility preservation techniques. Currently, no methods exist to accurately measure the number of primordial follicles comprising the ovarian reserve in women. Furthermore, obtaining ovarian tissue from large animals or endangered species for experimentation is often not feasible. Thus, mice have become an essential model for such studies, and the ability to evaluate primordial follicle numbers in whole mouse ovaries is a critical tool. However, reports of absolute follicle numbers in mouse ovaries in the literature are highly variable, making it difficult to compare and/or replicate data. This is due to a number of factors including strain, age, treatment groups, as well as technical differences in the methods of counting employed. In this article, we provide a step-by-step instructional guide for preparing histological sections and counting primordial follicles in mouse ovaries using two different methods: [1] stereology, which relies on the fractionator/optical dissector technique; and [2] the direct count technique. Some of the key advantages and drawbacks of each method will be highlighted so that reproducibility can be improved in the field and to enable researchers to select the most appropriate method for their studies.

Here, we describe, compare, and contrast two different techniques for accurate follicle counting of fixed mouse ovarian tissues.