Cette méthode est très avancée. Il a les divisions du domaine de la biotechnologie telles que l’ingénierie tissulaire, la thérapie générative gratuite et le dépistage médicamenteux. Le principal avantage de cette technique est que des agrégats de taille uniforme peuvent être produits dans une culture simple et suspendue.
Ce conseil représente la possibilité des nouveaux vaisseaux en forme d’O pour la production d’agrégats uniformes de cellules mammifères dans la culture orbitale de suspension secouant. Dans la culture des secousses orbitales avec les vaisseaux conventionnels, le flux circulaire se produit en raison de la force centrifuge de la surface moyenne, et ce flux moyen transfère les cellules vers le fond central des vaisseaux. Cet effet est bien connu sous le nom de paradoxe einsteins feuille de thé.
Cet effet provoque une accumulation excessive de cellules dans le fond central des cellules et l’agrégation inhomogène. D’autre part, les vaisseaux en forme d’O éliminent la région centrale qui empêche les cellules de balayage à débit moyen dans la région du centre-bas. Cela limite l’accumulation de cellules qui peuvent réaliser une agrégation homogène.
Commencez par un flacon de 25 centimètres carrés de cellules HEK-293 pour que chaque vaisseau soit assis. Dissocier les cellules à l’aide de la solution Trypsin-EDTA à 0,25 % et recueillir les cellules par centrifugation. Resuspendez la pastille résultante dans un millilitre de milieu de culture.
Filtrer la suspension cellulaire à l’aide d’une passoire cellulaire de 40 microns pour recueillir une suspension à cellule unique. Ajouter trypan bleu à un aliquot de la suspension cellulaire et effectuer un nombre de cellules. Ensuite, préparez 20 millilitres de suspension cellulaire à 2 fois 10 à la 5ème cellule par millilitre.
Connectez l’entrée du sac en forme d’O à une seringue serrée de 50 millilitres, puis détachez le piston. Abaissez la suspension cellulaire préparée dans le sac en forme d’O à travers la seringue serrée. Remplacer la première seringue à pince par une seringue propre.
Ajouter 55 millilitres d’air à travers la seringue propre pour agrandir complètement le sac. Battre le tube d’entrée, puis fermer l’entrée. Enfin, retirez la pince du tube.
Incuber les cellules dans le sac en forme d’O avec des secousses à 45 rpm dans des conditions de 35 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Pour changer le milieu dans les cellules, transférez d’abord la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres, via l’entrée. Puis centrifugeuse pendant deux minutes à 200G à température ambiante.
Après avoir aspiré le surnatant, ajouter 20 millilitres de milieu de culture et résuspendre les cellules. Ajouter les cellules résuspendus au sac en forme d’O comme avant et remettre le sac scellé à l’incubateur secouant. Pour recueillir les cellules, transférer la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres à travers l’entrée, comme avant.
Laver l’intérieur du sac avec 20 millilitres de calcium, sans magnésium sans phosphate tamponné saline, puis égoutter le contenu dans un tube pour recueillir les cellules restantes du sac. Centrifuger la suspension cellulaire collectée pendant trois minutes à 200 fois G à température ambiante, puis aspirer le supernate. Ajouter 10 millilitres de calcium, sans magnésium PBS et regarder les agrégats.
Après avoir centrifugé comme avant, retirer le supernate et laisser la pastille contenant les agrégats. Si un dénombrement cellulaire est nécessaire, ajouter quatre millilitres de PBS et un millilitre de trypsine aux agrégats et incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius pour dissocier les cellules pour le comptage. Les mesures expérimentales montrent que les agrégats cultivés dans le plat conventionnel, avaient des diamètres variés après cinq jours dans les secousses orbitales.
En revanche, les agrégats cultivés dans des plats ou des sacs en forme d’O pendant cinq jours, avaient des diamètres beaucoup plus uniformes. Selon la mesure de la taille basée sur l’image, la culture conventionnelle des plats a montré deux pics différents, ce qui indique un écart important de la taille globale. D’autre part, les agrégats dans les plats en forme d’O et les sacs en forme d’O ont montré un pic unique et moins de déviation de diamètre que ceux dans le plat conventionnel, ce qui suggère que ces agrégats peuvent être de qualité plus uniforme.
L’hématoxyline et la coloration de l’éosine des sections transversales agrégées ont montré que les agrégats cultivés dans le plat conventionnel avaient des cellules dénucléées et un cours nécrotique; mais les agrégats cultivés dans les vaisseaux en forme d’O ne montraient aucun cours nécrotique et les agrégats cultivés dans le sac en forme d’O étaient aussi grands que ceux du plat conventionnel. Le nombre de cellules a montré que plus de 85% des cellules ont survécu pendant cinq jours de culture de suspension dans chaque vaisseau. Cette vidéo montre comment manipuler de nouveaux vaisseaux en forme d’O pour la production d’agrégats uniformes de sites de cellules mammifères dans une culture de suspension simple.
