Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation national suisse (31003A_135278) à SST. MOP est le bénéficiaire d&#39;une bourse doctorale du Fonds AXA pour la Recherche. Nous remercions Patricia Nigg de l&#39;aide à la conception de la figure 1.

Remarque avant le début: hotte utilisation de flux laminaire et de confinement biologique appropriée lorsque l&#39;on travaille avec le virus vivant. Ici, nous décrivons des conditions appropriées pour la culture de la souche de virus influenza A / WSN / 33 de croissance. Multiplicité d&#39;infection (MOI) et incubation fois peuvent varier selon souche virale utilisée. 1. Préparation de biotinylé A / WSN / 33 Virus <ol><li> Graine Madin-Darby canine kindey (MDCK), les cellules dans un flacon T175 cm 2 en utilisant du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine (Pen / Strep). Des cellules de culture à 37 ° C jusqu&#39;à environ 70% de confluence est atteinte. </li><li> Avant l&#39;infection, éliminer le milieu et laver les cellules avec un tampon phosphate salin (PBS, pH7.0-7.3) en ajoutant un volume suffisant pour couvrir la monocouche cellulaire. </li><li> Retirer du PBS et infecter les cellules avec A / WSN / 33 avec un MOI de 10 -4. Diluer virus dans PBS complété avec 0,02 mg Mg 2+, Ca 2+ 0,01 mg &lt;/ sup&gt;, 0,3% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) et 1% de Pen / Strep (-infection PBS). Utiliser un inoculum de 4 ml pour un flacon T175 cm 2. </li><li> Incuber les cellules 1 heure à 37 ° C. Retirer inoculum par aspiration et la pipette 10 ml du DMEM supplémenté avec 0,3% de BSA, 20 mM de HEPES et 1% de Pen / Strep dans le ballon. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C pendant environ 3 jours jusqu&#39;à ce que l&#39;effet cytopathique (CPE) est visible, et ensuite la récolte surnageant. CPE peut être reconnu comme arrondissement des cellules, suivie par le détachement et la mort des cellules 14. </li><li> Spin surnageant à 450 g pendant 5 min pour éliminer les débris cellulaires. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de faucon et répétez cette étape une fois de plus. Jeter les pastilles. </li><li> Les surnageants dans des tubes de transfert d&#39;ultracentrifugation des surnageants et sous-couche de 5 ml de saccharose à 30% dilué dans du tampon NTE (Tris 10 mM [pH 7,4], NaCl 100 mM, EDTA 1 mM). Équilibrer tubes avant ultracentrifugation et remplir avec du PBS pour atteindre un volume de 30 ml de fin. Spin supernatants à 112 398 xg (correspondant à 25 000 tours par minute pour un rotor SW28) pendant 90 min dans une ultracentrifugeuse. </li><li> Retirez délicatement surnageant par pipetage et laisser tremper culot de virus nuit à 4 ° C dans 250 pi de PBS. Remettre en suspension pastille par aspiration et vers le bas. Mesurer la teneur en protéines de virus purifié par dosage Bradford 15. </li><li> Utilisez un kit de biotinylation pour générer biotinylé A / WSN / 33. Suivez les instructions du fabricant. </li><li> En bref, ajouter la quantité appropriée de la biotine au virus purifié et incuber pendant 2h sur la glace. Transférer le virus à un tube d&#39;ultracentrifugation et remplir le tube avec PBS pour atteindre un volume de 30 ml de fin. Spin virus à 112 389 g pendant 90 min dans une ultracentrifugeuse. Retirer le surnageant par pipetage et ajouter 250 ul de PBS. Faire tremper granulés pendant la nuit à 4 ° C. Aliquoter et stocker le virus biotinylé stockés à -80 ° C où il sera stable pendant au moins 24 mois. NOTE: Il peut être utile pour déterminer le titre de la p biotinyléréparation des IAV par dosage de plaque standard. Toutefois, il convient de noter que le protocole ultérieur ne mesurer particules virales biotinylés. Restant particules non biotinylé en raison de biotinylation incomplet contribuera au titre infectieux par dosage de plaque, mais pas au signal mesuré dans l&#39;essai de fixation / internalisation. </li></ol> 2. Déterminer le montant requis de biotinylé Virus REMARQUE: Avant l&#39;essai de fixation / internalisation est effectuée, il est important de déterminer la quantité de virus biotinylé nécessaire d&#39;infecter toutes les cellules d&#39;un échantillon. <ol><li> Culture des cellules A549 et Trypsiniser selon les instructions du fabricant. Compter les cellules à l&#39;aide d&#39;une chambre de cellule. Pipettes cellules 200.000 A549 en FACS DEEPWELL tubes. Spin 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre le culot avec 200 pi de PBS. Cellules refroidir sur glace pendant 10 min. </li><li> Préparation de 5 fois des dilutions en série de la biotinylated stock de virus dans l&#39;infection-PBS. </li><li> Des tubes de centrifugation contenant les cellules à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre le culot avec 100 ul contenant le virus infection PBS. Comme l&#39;utilisation de commande maquette infection PBS sans virus biotinylé. Incuber les tubes sur de la glace pendant 1 heure. </li><li> Des tubes de centrifugation à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 200 pi de PBS. Répétez cette étape une fois de plus. </li><li> Pour la fixation, des tubes de rotation à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 100 ul de 3,7% de paraformaldehyde (PFA). Incuber pendant 10 min à température ambiante. Ensuite, répétez l&#39;étape de lavage décrit dans 2.4). </li><li> Pour perméabilisation, les tubes de rotation à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 100 pl de PBS contenant 0,5% de Triton X-100. Incuber pendant 6 min à température ambiante. Ensuite, répétez l&#39;étape de lavage décrit dans 2.4). </li><li> Des tubes de centrifugation à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre en suspension pêleet dans 50 ul de BSA à 2% dilué dans du PBS contenant STV-Cy3. (S&#39;il vous plaît noter, la concentration appropriée de STV-Cy3 devrait être déterminé avant de commencer l&#39;expérience Commencez avec une concentration de 1:. 200 et le test des dilutions d&#39;un facteur 2 à 1:. 2.400 Dans nos mains, une dilution de 1: 1,000 prouvé comme optimale). </li><li> Incuber 1 h dans l&#39;obscurité à la température ambiante. Ensuite, répétez l&#39;étape de lavage décrite dans 2.4 mais Reprendre le culot dans 200 pi 2% de BSA dilué dans du PBS. </li><li> Analyser des échantillons par cytométrie de flux 16. Porte sur la population Cy3-positif. Choisir la plus faible concentration de virus dans le biotinylée résultante nombre maximum de cellules positives-Cy3 dans la population A549. </li></ol> 3. Déterminez la quantité requise de streptavidine NOTE: L&#39;efficacité du blocage du signal dérivé du virus extracellulaire détermine la plage de détection du dosage. Par conséquent, il est important d&#39;abroger le signal STV-Cy3 autant que possible. The montant requis de STV nécessaire dépend de la quantité de stock de virus utilisé biotinylé (déterminée à l&#39;article 2). <ol><li> Suivez les étapes 2.1-2.4, mais utiliser la concentration de virus déterminé à l&#39;article 2. </li><li> Préparer des dilutions en série de cinq pliage de STV dilué dans du PBS contenant 2% de BSA et de l&#39;azide de sodium à 0,1%. </li><li> Des tubes de centrifugation à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 50 ul STV dilution. Comme l&#39;utilisation de commande maquette PBS contenant 2% de BSA et de l&#39;azoture de sodium à 0,1%, sans STV. Incuber les tubes pendant 30 minutes sur la glace. Ensuite, l&#39;étape de lavage répétition décrit dans 2.4. </li><li> Suivez les étapes 2.5 à 2.9. Pour le dosage de l&#39;internalisation, choisir la plus faible concentration de STV résultant en un bloc fort de la Cy3-signal (par rapport à l&#39;échantillon dans lequel aucun STV était présent). Pour cela, le pourcentage de cellules positives à Cy3 ou l&#39;intensité moyenne du signal de fluorescence Cy3 peut être utilisé. Idéalement, le signal Cy3 d&#39;échantillons STV-traités devrait être aussi proche du signal de faussement infectéescellules que possible. </li></ol> 4. Fixation / Internalisation Assay NOTE: Assurez-vous de préparer tous les réactifs avant de commencer le test. Pour les trois groupes de contrôle présentés dans la section des résultats (cellules infectées simulées, les cellules pré-traitées neuraminidase et les cellules azoture de sodium) traités de petites modifications au protocole sont obligatoires. <ol><li> Préparer 16 tubes deepwell contenant chacune 200.000 cellules A549. Suivant à l&#39;ensemble expérimentale composée de 4 tubes, il ya 3 conditions de contrôle, chacune nécessitant des 4 tubes: cellules pseudo-infectées, la neuraminidase (NA) -pretreated cellules et des cellules traitées azoture de sodium. Chaque groupe se compose de 4 tubes étiquetés comme «0 min», «0 min + STV &#39;, &#39;30 minutes&#39;, &#39;30 min + STV. </li><li> Des tubes de centrifugation à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 200 pi de PBS. </li><li> Des tubes de centrifugation à 4 ° C à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre en suspension pêleet dans 200 ul de DMEM contenant 0,3% de BSA, 20 mM de HEPES et 1% (de milieu d&#39;incubation) de pénicilline-streptomycine. Incuber pendant 30 min à 37 ° C. NOTE: Pour le contrôle de la neuraminidase: Utilisation de la neuraminidase bactérienne (par exemple la sialidase de Vibrio cholerae) à une concentration de 200 mU / ml diluée dans du milieu d&#39;incubation pour remettre en suspension les cellules. </li><li> Des tubes de centrifugation à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 200 pi de PBS. Répétez cette étape une fois de plus, puis les tubes refroidir sur glace pendant 10 min. </li><li> Des tubes de centrifugation à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 100 pi virus biotinylé (utiliser la concentration de virus déterminé à l&#39;article 2 dilué dans l&#39;infection PBS). Incuber 1 h sur de la glace. Ensuite, l&#39;étape de lavage répétition décrit dans 2.4. NOTE: Pour la maquette infectés contrôle: utilisation infection PBS sans virus. Pour le contrôle de l&#39;azoture de sodium: Utilisation virus dilué dans du PBS-infection supplémenté avec de l&#39;azide de sodium à 0,1%. </li><li> Protransformation des échantillons après l&#39;infection sur la glace: <ol><li> Pour les échantillons «0 min», suivez l&#39;étape 2.5 et de stocker des échantillons à 4 ° C jusqu&#39;à ce que les autres échantillons sont fixés. </li><li> Pour le &#39;0 min + STV&#39; échantillons, tubes de spin à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 50 ul STV (utiliser la concentration déterminée à l&#39;article 3) dilué dans du PBS contenant 2% de BSA et de l&#39;azoture de sodium à 0,1% (pour éviter l&#39;internalisation lors de la manipulation de l&#39;échantillon). Incuber 30 min sur la glace. Suivez l&#39;étape 2,4-2,5 et stocker des échantillons à 4 ° C. </li><li> Pour les échantillons &#39;&#39;30 min, les tubes de rotation à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 200 pl de PBS contenant 2% de BSA. Incuber 30 min à 37 ° C. Suivez l&#39;étape 2,4-2,5 et stocker des échantillons à 4 ° C. NOTE: Pour le contrôle de l&#39;azoture de sodium: Utilisation du PBS supplémenté avec 2% de BSA et de l&#39;azide de sodium à 0,1% pour les 30 minutes d&#39;incubation à 37 ° C. </li><li> Pour la &#39;30 min + échantillons STV &quot;SPIN tubes à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 200 pl de PBS contenant 2% de BSA. Incuber 30 min à 37 ° C. Ensuite, les tubes de rotation à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 50 ul STV (utiliser la concentration déterminée à l&#39;article 3) dilué dans du PBS contenant 2% de BSA et de l&#39;azoture de sodium à 0,1% (pour éviter l&#39;internalisation lors de la manipulation de l&#39;échantillon). Incuber 30 min sur la glace. Suivez l&#39;étape 2,4-2,5 et stocker des échantillons à 4 ° C. NOTE: Pour le contrôle de l&#39;azoture de sodium: Utilisation du PBS supplémenté avec 2% de BSA et de l&#39;azide de sodium à 0,1% pour les 30 minutes d&#39;incubation à 37 ° C. </li></ol></li><li> Suivre les étapes 2,6-2,8 et analyser les échantillons par cytométrie en flux. Déterminer le pourcentage de cellules positives à Cy3 dans chaque échantillon. </li><li> Calculer le pourcentage de virus ci-joint et la quantité relative de virus intériorisé. <ol><li> Pour calculer la quantité de virus en pièce jointe, utilisez le pourcentage de Cy3-positive cellules bloquées ou l&#39;intensité de fluorescence moyenne du signal Cy3. A titre de comparaison, définir les cellules non traitées à 100% (figure 4B). NOTE: Le pourcentage de virus en pièce jointe est décrite par l&#39;échantillon &quot;0 min&quot;. </li><li> Pour calculer la quantité de virus intériorisé, prendre le rapport de la &quot;30 min + STV&quot; échantillon à la &quot;30 min&quot; échantillon (figure 5B). Remarque: Comme mentionné ci-dessus, le pourcentage de cellules positives gated Cy3 ou l&#39;intensité moyenne du signal de fluorescence Cy3 peut être utilisé. </li></ol></li></ol>

<ol>
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U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+enzymes+on+the+attachment+of+influenza+and+encephalomyocarditis+viruses+to+erythrocytes.">Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes.</a> J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Notre protocole décrit un moyen facile de mesurer l&#39;attachement du virus et de l&#39;internalisation par cytométrie de flux. Il permet l&#39;utilisation de virus de type sauvage marqué qui imite plus étroitement les infections virales par rapport à l&#39;utilisation de particules de type virus (VLP). Alors que notre protocole a été optimisé pour mesurer l&#39;attachement et l&#39;internalisation des IAV il peut facilement être adapté à d&#39;autres virus. En outre, comme la cytométrie de flux est utilis?...

L&#39;entrée de virus de la grippe A (IAV) est un processus en plusieurs étapes qui commence par la liaison du virus aux récepteurs sur la membrane plasmique des cellules cibles 1. Le récepteur de l&#39;acide sialique est IAV qui est présente sur une grande variété de glycoprotéines et des glycolipides. La protéine hémagglutinine (HA) de IAV qui est présent dans l&#39;enveloppe virale se lie à l&#39;acide sialique et médie ainsi la fixation des particules virales à la membrane plasmique de cellules cibles 2. Le virus pénètre dans les cellules par endocytose clathrine mais aussi les voies d&#39;entrée alternatifs, tels que macropinocytose, ont été décrits 3-6. L&#39;interaction entre HA et l&#39;acide sialique semble être suffisante pour la médiation à la fois, l&#39;attachement et le déclenchement de l&#39;internalisation de particules virales 7. Néanmoins, les récepteurs d&#39;entrée alternatives ont été proposées et leurs rôles dans IAV entrée sont actuellement à l&#39;étude 1,8,9. Cabotment, des efforts sont faits pour identifier les facteurs de l&#39;hôte qui sont impliqués dans le cycle de vie du virus dans le but de développer de nouveaux traitements antiviraux nécessaires de toute urgence 10-12. L&#39;entrée du virus serait une étape favorable pour cibler la croissance IAV afin de bloquer l&#39;infection virale à son premier stade. Mesure différentes étapes de IAV entrée expérimentalement est généralement difficile que de grandes quantités de virus sont nécessaires pour détecter des virus entrant. En outre, la plage de détection des variations de l&#39;entrée du virus est uniquement linéaire en raison de l&#39;absence de réplication virale. Cela souligne la nécessité pour les essais avec une grande sensibilité. Le test que nous présentons ici permet la détection de virus attaché à la surface des cellules ainsi que la détection de virus internalisé par rapport à la quantité totale de virus associé aux cellules. L&#39;utilisation de virus de type sauvage biotinylé permet une mesure pratique à travers la coloration avec STV-Cy3 et la lecture par cytométrie de flux. Virus biotinylé est froid lié à la cellules pour permettre la fixation mais empêche l&#39;internalisation des particules virales. Les cellules peuvent être fixées, perméabilisées et colorées avec STV-Cy3 pour mesurer virus en pièce jointe. Le signal provenant de virions extracellulaires, attachés peut être abrogée si une étape de blocage est appliqué avant la fixation, dans lequel les cellules sont incubées avec de la streptavidine non marqué (STV). Dans une prochaine étape, après la fixation du biotinylé IAV, la température est décalée à 37 ° C et l&#39;internalisation des particules virales est autorisé à prendre place. Particules internalisées sont protégés de liaison de STV permettant ainsi à la discrimination entre les virus extra- et intracellulaires. Par condition expérimentale, quatre échantillons sont nécessaires: «0 min»: Le premier échantillon, appelée «0 min», est de mesurer le virus froid lié à la surface de la cellule. &#39;0 min + STV&#39;: Le deuxième échantillon, appelée «0 min + STV», donne la ligne de base l&#39;intensité du signal de l&#39;expérience. Virus en pièce jointe est bloquée esprith STV et le signal après coloration avec STV-Cy3 devraient être beaucoup plus faible par rapport à l&#39;échantillon «0 min». &#39;30 Minutes &#39;: Le troisième échantillon, &#39;30 minutes&#39; contient fixée intériorisé et le virus en raison de la variation de température à 37 ° C pendant 30 min. &#39;30 Min + STV &#39;: Le quatrième échantillon, &#39;30 min + STV »mesure la fraction intracellulaire des virus. L&#39;étape de blocage STV est appliqué après la période d&#39;incubation de 30 min. Par conséquent, les particules virales à la surface des cellules sont liés par STV laissant seulement les virus internalisés disponible pour la coloration avec STV-Cy3. La quantité relative de virus intériorisé peut être calculé comme le ratio du virus intériorisé (mesurée dans le &#39;30 min + STV &#39;échantillon) divisée par la quantité totale de virus (décrit par le &#39;30 minutes&#39; échantillon). Comme témoins, nous proposons d&#39;inclure des cellules pseudo-infectées. Le signal suivant STV-Cy3 coloration des cellules pseudo-infectées donne l&#39;arrière-planrésultant du protocole de coloration. Un contrôle pour la fixation IAV est le pré-traitement des cellules avec la neuraminidase bactérienne (NA). NA hors clive l&#39;acide sialique à partir de glycoprotéines cellulaires, éliminant ainsi les récepteurs de fixation à partir de la surface cellulaire. L&#39;azoture de sodium (SA) est un inhibiteur métabolique puissant et bloque ainsi l&#39;endocytose 13. Les cellules traitées avec de l&#39;azoture de sodium devraient être positifs pour la liaison du virus mais négatif pour l&#39;internalisation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-169&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR Calbiochem</td>
			<td>126579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>84100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Biosolve BV</td>
			<td>20092391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E">W9971E&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio Rad Protein Bio Assay</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deepwell tubes (1.2 ml microtubes)</td>
			<td>Milian</td>
			<td>82 00 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>&#160;Lucerna chem&#160; Electron microscopy sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Hemotec HmbH</td>
			<td>253070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STV-Cy3</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>43-4315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STV</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>43-4302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacterial neuraminidase/sialidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6514-1UN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring attachment and internalization of influenza a virus in a549 cells by flow cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

Une bande dessinée décrivant les quatre conditions expérimentales différentes est illustrée à la figure 1 Résultats d&#39;une expérience représentative sont présentés dans les figures 2 -. 5. Dans l&#39;exemple &quot;0 min&quot;, virus biotinylée est liée à froid à des cellules cibles qui peuvent être visualisées par coloration STV-Cy3 (figures 1 et 2). Quand une étape de blocage (dans...

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Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

Mesurer l&#39;attachement et l&#39;internalisation du virus grippal A dans les cellules A549 par cytométrie en flux

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K vues.  University of Zurich. We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry. 

Vidéo: Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Mesure de l&#39;activité calpaïne dans des cellules fixées et de la Vie par cytométrie en flux

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Recherche

Immunologie et infection

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

L&#39;examen de sélection positive et négative thymique par cytométrie en flux

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Virus de la grippe Propagation dans embryonnés de poulet Oeufs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro désassemblage du virus grippal A capsides par Centrifugation Gradient

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

Études de Virus influenza de type A dans un modèle murin d’Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Grippe neutralisante d’anticorps aux virus a (H3N2) dans le sérum humain par micro-neutralisation de mesure des analyses utilisant des cellules de MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolement et la Culture In Vitro de Macrophages alvéolaires murines et humaines

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Préparation de la moelle osseuse entière pour l'analyse de la cytométrie de masse des cellules de lignée neutrophile

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Mesure de la phagocytose d'Aspergillus fumigatus Conidia par des leucocytes humains à l'aide de la cytométrie du flux

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and generation of high-affinity antibodies. In influenza virus infection, robust Tfh and GC B cell responses are induced to facilitate effective virus eradication, which confers a qualified mouse model for Tfh-associated study. In this paper, we described protocols in detection of basic Tfh-associated immune response during influenza virus infection in mice. These protocols include: intranasal inoculation of influenza virus; flow cytometry staining and analysis of polyclonal and antigen-specific Tfh cells, GC B cells and plasma cells; immunofluorescence detection of GCs; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of influenza virus-specific antibody in serum. These assays basically quantify the differentiation and function of Tfh cells in influenza virus infection, thus providing help for studies in elucidating differentiation mechanism and manipulation strategy.

This paper describes protocols of evaluating Tfh and GC B response in mouse model of influenza virus infection.