We thank Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco and Avani Vaishnav for assistance with optimizing this methodology over the years and Yang Zhang and Dr. Jian Ma at the University of Illinois at Urbana-Champaign for the RNA seq analysis. This work was supported by NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) and a Prevent Cancer Foundation grant (Zhou).

Tous les tissus humains utilisés pour ces expériences ont été acquises via un protocole et / ou exemption Institutional Review Board a approuvé à l&#39;Université de l&#39;Illinois à Chicago. 1. L&#39;article frais congelé prostate sur PEN-toboggan et sur Charged Glisser verre <ol><li> Le jour avant ou quelques heures avant le sectionnement de l&#39;échantillon, des outils propres (c.-à-pinceau, la pince, coplins, des lames, des diapositives PEN-encadrés (si pas déjà RNase), un marqueur de ETOH fort et d&#39;un crayon) et l&#39;intérieur d&#39;un RT cryostat avec une solution RNase-décontaminer l&#39;aide d&#39;un flacon pulvérisateur et Lab-lingettes. <ol><li> Laisser la solution de RNase-décontamination reposer pendant 5 min avant essuyant, rincer à l&#39;depcH 2 0 pour supprimer gauche sur la solution et un rinçage final avec 70% EtOH (préparé avec depcH 2 0) RNase-décontamination. Remarque: Il est essentiel de maintenir un espace de travail sans RNase. Tous coplins, outils, milieu de montage congelés, des lames et des diapositives utilisées doivent être utilisés uniquement pour la RNase travail libreet jamais utilisé dans un environnement libre standard non-RNase. Tous les instruments doivent être traités avec une solution de décontamination RNase avant chaque expérience. </li></ol></li><li> Cryostat Refroidir à -24 ° C. </li><li> Placez les instruments nettoyés sans RNase suivants intérieur cryostat pour refroidir au moins 30 min avant la coupe: toboggan Coplin remplie avec 100% d&#39;éthanol, les outils, les petites cassettes de tissus congelés et le mandrin de montage. </li><li> Récupérer le tissu de la prostate congelé de cryoconservation et le lieu en une mousse seau sec rempli de glace pour le transport. Placez le tissu dans cryostat à équilibrer cryostat à température pendant au moins 30 min. Remarque: les tissus de la prostate humaines pour laser capture microdissection peuvent être soit frais congelé ou fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE). Les contraintes de temps et de préparation des lames sont légèrement différentes entre les sources de tissus. Nous décrivons ici les étapes de coupes congelées. </li><li> Travailler avec un tissu à la fois, et gicler milieu de montage congelé dans le bottom de la cassette et monter rapidement le tissu de la prostate congelées dans le milieu de montage à l&#39;aide des pinces congelés réfrigérés. </li><li> Placez la cassette avec le tissu sur refroidisseur en cryostat pendant 5 min à mettre en milieu de montage congelé. </li><li> Appliquer une petite quantité de milieu de montage congelé sur le mandrin et appuyez avec précaution sur le tissu monté côté bas en haut sur le support de montage congelé. Laisser reposer dans le cryostat pendant 5 min pour permettre au milieu de montage congelés se solidifier complètement. </li><li> Placez le mandrin dans le support et serrer. </li><li> Verrouiller la poignée en position verrouillée et placez une nouvelle lame sur le cryostat. Pour extrémités moléculaires en aval qui incluent une étape d&#39;amplification (c.-à-qPCR), il est conseillé d&#39;utiliser une nouvelle lame pour chaque patient afin de prévenir la contamination (ou déplacer la lame sur pour utiliser la zone de la lame pour l&#39;échantillon suivant). </li><li> Déverrouillez la poignée et faire progresser attentivement le tissu à la main ou avec une pédale pour égaliser et exposer le tissu avec 50 μdes sections de m jusqu&#39;à ce que l&#39;exposition de tissu désiré est atteint. </li><li> Réglez cryostat à 5 pm, couper une ou deux sections et les placer sur lame de verre facturé pour hématoxyline et l&#39;éosine (H &amp; E) coloration (voir étape 2). </li><li> Immédiatement placer la lame dans le froid éthanol à 100% pendant 2 min. </li><li> Retirer la lame de verre chargée de l&#39;éthanol et le laisser sécher à la température ambiante avant de procéder à coloration H &amp; E (étape 2). </li><li> Placez RT PEN-cadre diaporama sur un support de cadre. </li><li> Réglez cryostat à 10 sections um et placer sur les lames de trame RT PEN. Une à quatre sections peut être placé sur chaque coulisseau fonction de la taille des tissus. </li><li> Immédiatement plonger la lame dans le froid éthanol à 100% pendant 2 min. </li><li> Retirez les diapositives PEN-cadre de l&#39;éthanol et de stocker la diapositive dans une boîte de diapositives dans une boîte de dessiccateur dans un -80 ° C au congélateur jusqu&#39;au moment de LCM. Trois jours est la durée maximale de stockage pour la récupération de l&#39;ARN optimale. </li><li> Passez à l&#39;étape 2 pour SEULEMENT le verre chargée glissae. Passez à l&#39;étape 3 pour PEN-cadre diapositive. </li></ol> 2. hématoxyline et l&#39;éosine-Y (H &amp; E) pour les taches histologique Mark-up Note: Cette si pour le tissu sur la lame de verre armé, pas la diapositive PEN-cadre pour LCM. <ol><li> Hydrater les sections sur la lame de verre chargée plongeant le glisser à travers l&#39;éthanol classés comme suit: plonger la lame deux fois dans l&#39;éthanol 100% pendant 3 min, deux fois en éthanol à 95% pendant 3 min, une fois dans éthanol à 70% pendant 3 minutes et deux fois distillée H 2 O pour 3 min. <ol><li> Préparer une solution d&#39;alcool de l&#39;acide: 99 ml éthanol à 70% + 1 ml de HCl 1% et une solution de bicarbonate de sodium à 0,1%: 0,1 g de bicarbonate de sodium dans 100 ml de H 2 O distillée, </li></ol></li><li> Plonger la lame dans hématoxyline Gill II (0,4%) pendant 5 min. </li><li> Lavez tout surplus tache dans la course constante prise H 2 O pendant 3 min. </li><li> Plonger la lame 10 fois dans l&#39;alcool acide </li><li> Laver la lame dans le robinet coule H 2 O pendant 3 min. </li><li> Plonger la lamedans une solution de bicarbonate de sodium à 0,1% pour 30 à 60 secondes pour mettre la couleur pourpre au bleu. </li><li> Laver la lame dans le robinet coule H 2 O pendant 3 min. </li><li> Rincer la lame à 95% d&#39;éthanol avec 10 trempettes. </li><li> Plonger la lame dans les temps Eosine-Y 2-3 pour un total de 15 sec. </li><li> Déshydrater le glisser à travers l&#39;éthanol classés comme suit: plonger la lame deux fois dans l&#39;éthanol 95%, deux fois dans l&#39;éthanol 100%, et deux fois dans le xylène (assurez-vous que le tissu semble clair qui indique la déshydratation approfondie). </li><li> Montez la lame avec non aqueux dur milieu de montage et lamelle permanente. </li><li> Laissez la lame sèche pendant 30 min. </li><li> Numériser diapositives avec un scanner de diapositives ensemble et imprimer une grande image à haute résolution sur 8 &quot;x 11&quot;. </li><li> Outline zones d&#39;intérêt (généralement effectuées par un pathologiste certifié conseil) avec un marqueur. Ce balisage est le guide de la procédure de LCM. </li></ol> 3. Bleu de Toluidine Coloration des diapositives PEN-cadre Remarque: Thest se fait le même jour que le LCM. Utilisez depcH 2 O de l&#39;eau pour toutes les solutions. Terminez toutes les étapes de zone de libre-RNase. Tous coplins doivent être nettoyés avec une solution RNase-décontamination. <ol><li> Le jour de LCM supprimer les diapositives PEN-cadre de -80 ° C congélateur et hydrate par diapositives plongeant doucement dans 90% EtOH pendant 2 min puis EtOH à 75% pendant 2 min. <ol><li> Préparer 0,5% de bleu de toluidine par dissolution dans l&#39;eau moléculaire de qualité biologie puis filtrer à travers un filtre stériliser et stocker 0,2 um à TA. Cette solution peut être réutilisée pour un maximum de 6 mois. Remarque: Il est fortement conseillé de préparer la solution avant que la filtration peut prendre quelques heures. </li></ol></li><li> Colorer le tissu de la prostate en plongeant doucement glisse dans 0,5% de bleu de toluidine pour 5-30 sec. Destain le tissu par lavage glisse 2 fois dans depcH 2 O pendant 15 secondes suivi par 75% EtOH pendant 30 secondes à 3 minutes. Remarque: tache et Destain temps peuvent être ajustés pour assurer une bonne coloration. La prostate tend à plus de tache. </li><li&gt; Transfert diapositives PEN-cadre au conteneur sec RNAase-libre sur la glace. </li></ol> 4. laser capture microdissection (LCM) <ol><li> Immédiatement avant LCM, toboggan sec sur une lame chaude à 42 ° C pendant 15 min. Sec seulement la diapositive qui seront traitées et stocker le reste sur la glace jusqu&#39;à ce que prêt pour eux. </li><li> Tournez sur LCM et l&#39;ordinateur dans cet ordre, la puissance du microscope, la clé de laser, le commutateur laser, puis l&#39;ordinateur. Lancez le logiciel microdissection laser. </li><li> Utilisez le logiciel pour contrôler le microscope pour charger les diapositives et les tubes de prélèvement. Cliquez sur &quot;porte-échantillon de déchargement&quot;, charger la lame avec les sections sur le support de lame de microscope avec le tissu vers le bas et insérez le support de diapositives dans la fente appropriée dans le microscope, puis cliquez sur &quot;Continuer&quot;. <ol><li> Cliquez sur &quot;tubes de collecte de déchargement&quot;, étiquette et charger tubes de 0,5 ml sur support de tube et l&#39;insérer dans la fente appropriée dans l&#39;instrument. Une seul foiscapuchons sont fixés, ajouter 35 pi de tampon de lyse pour les bouchons de collecte et d&#39;essayer d&#39;éviter les bulles. Puis cliquez sur &quot;OK&quot;. Remarque: Si l&#39;évaporation est un problème, diluer le tampon comme suit: tampon de lyse de 25 pi avec 10 ul depcH2O. </li></ol></li><li> Dans le logiciel, sélectionnez la position où la lame a été placée dans le support de diapositives. Sélectionnez le capuchon de recouvrement pour récupérer l&#39;échantillon de LCM. </li><li> Visualisez et concentrer le glisser à travers l&#39;ordinateur à 10X. Utilisez le logiciel pour calibrer le laser en sélectionnant &quot;Laser&quot;, puis &quot;calibrer&quot;. Réglez la puissance, ouverture et la vitesse du laser, en sélectionnant &quot;laser&quot; puis &quot;commande&quot; pour permettre au faisceau laser pour couper la zone sélectionnée complètement et efficacement. Répétez jusqu&#39;à ce que les ajustements des découpes au laser complètement à travers le tissu. </li><li> Utilisation du pathologiste majoration 8 &quot;x 11&quot; comme un guide, utilisez l&#39;outil &quot;dessiner la forme&quot; de circonscrire les zones souhaitées de épithéLIUM dans la vue et éviter toute collecte stroma. Remarque: Les zones multiples peuvent être sélectionnées dans une seule vue, mais ne se déplacent pas à une autre vue sans la première coupe en cliquant sur la fonction &quot;couper la forme&quot;. <ol><li> Si une zone ne soit pas complètement coupée par le laser utiliser l&#39;outil &quot;déplacer et couper&quot; pour aller sur manuellement. Continuer déplacer l&#39;objectif de nouveaux points de vue et répéter la découpe laser jusqu&#39;à ce diaporama est complètement disséqué ou la quantité désirée de tissu a été collecté (typiquement 100 glandes bénignes produisent 150-500 ng d&#39;ARN). (voir l&#39;exemple de la figure 1A). </li></ol></li><li> Retirez délicatement les tubes de la titulaire de la collecte et de fermer les bouchons, en étant conscient de la tampon de lyse et de tissus dans les bouchons. Centrifuger brièvement pendant 30 s pour recueillir le liquide et le tissu dans le fond du tube. Incuber les échantillons à 42 ° C pendant 30 min et conserver à -80 ° C jusqu&#39;au moment de l&#39;isolement de l&#39;ARN. </li></ol> 5. ARN isolement total avec un FilKit base-ter et de l&#39;analyse de la qualité <ol><li> Décongeler les tubes sur de la glace et pour apporter le volume de la solution à 100 ul. </li><li> Pré-mouiller le micro-filtre d&#39;un kit d&#39;isolement d&#39;ARN en appliquant 30 ul ofLysis Solution au centre du filtre et laisser tremper whileperforming les deux prochaines étapes (au moins 5 min). </li><li> Ajouter 3 pi de solution LCM Additif (fourni dans le kit) au lysat et mélanger au vortex pendant 5 sec. Centrifuger pendant 30 s pour recueillir le liquide au fond du tube. </li><li> Centrifuger le filtre de pré-humidifié pour ~ 30 secondes à la vitesse supérieure pour enlever le liquide. </li><li> Ajouter 1,25 volumes (dans ce cas 129 pi) de 100% d&#39;éthanol dans le mélange de lysat, doucement vortex ou d&#39;une pipette de haut en bas. ** Cette méthode va récupérer les deux espèces, grandes et petites ARN. </li><li> Charger l&#39;échantillon sur le micro-filtre préhumidifié, et centrifuger à 10 000 g pendant 1 min à se lier à l&#39;ARN du filtre. Puis, lavez micro filtre avec 180 pi de &quot;solution de lavage 1, R21; centrifuger à 10.000 xg pendant 1 minute. Note: De ce point sur toutes les centrifugations devrait être fait à 13.000 xg, ou la vitesse maximale. </li><li> Laver le filtre deux fois avec 180 pi de &quot;Les solutions de lavage 2 et 3&quot;, respectivement comme indiqué par le protocole de la trousse. Centrifugeuse pendant 30 secondes, puis défaussez l&#39;écoulement à travers, et tourner le filtre pendant 1 min pour éliminer le liquide résiduel et sécher le filtre. </li><li> Transfert filtre à un nouveau tube collecteur. </li><li> Solution chaude d&#39;élution à -95 ° C (fourni avec le kit). </li><li> Appliquer 10 pi de solution d&#39;élution préchauffé au centre du filtre, fermer le couvercle et les stocker pendant 5 min à température ambiante. Puis centrifuger pendant 1 min pour éluer l&#39;ARN, et répétez cette étape une fois pour obtenir ~ 20 pi d&#39;ARN. </li><li> Effectuer le traitement DNase I pendant 15 min à 37 ° C. </li><li> Quantifier l&#39;ARN par spectrophotomètre avec l&#39;absorbance à 260 nm. Le rapport de la densité optique aux longueurs d&#39;onde de 260 nm et 280 nm est utilisée pour évaluer la pureté del&#39;ARN (voir le tableau 1) 15. </li></ol> 6. Gene Expression Analysis Note: L&#39;expression des gènes d&#39;espèces d&#39;ARN longs (comme ARNm et lncRNAs) est affiché à l&#39;étape 6.1 et espèces d&#39;ARN courts (comme microARN) est représenté dans l&#39;étape 6.2. Différents kits sont disponibles pour la RT-qPCR et la quantité d&#39;ARN nécessaire varie selon le kit (aussi peu que 10 ng). Analyse de séquençage de l&#39;ARN est décrit dans le 6.3. <ol><li> Transcrire inverse (RT) de l&#39;ARN de l&#39;ADNc de 5 ul de mélange 20 ng / pl d&#39;ARN de l&#39;échantillon 5 ul du mélange maître RT (RT-tampon, des dNTP, des amorces aléatoires, RT enzyme, un inhibiteur de RNase). Incuber le mélange réactionnel pendant 25 min à 25 ° C, puis 120 minutes à 37 ° C et 5 min à 85 ° C. </li><li> Diluer la réaction RT à 1:10 avec RNase eau libre et utiliser 2,5 pi par 10 pi de réaction qPCR avec des amorces ou des ensembles amorce / sonde pour les gènes d&#39;intérêt. Note: Pour faciliter l&#39;analyse de l&#39;ARN partiellement dégradé Il est conseillé d&#39;utiliser des amorces for amplicons courts (moins de 100 pb) 16. (Tableau 2B) <ol><li> Pour l&#39;analyse de l&#39;expression de microARN exécuter la réaction de RT en mélangeant 5 pi de 2-10 ng / ul échantillon d&#39;ARN avec 5 pi de mélange maître RT. Remarque: chaque technologie de détection de microARN disponible dans le commerce basé sur la PCR nécessite l&#39;utilisation d&#39;amorces spécifiques et exclusifs RT. </li></ol></li><li> En variante ou en plus de la RT-PCR, en utilisant le séquençage de la prochaine génération (ARN-seq-ARN ou petit-seq) pour quantifier les différentes espèces d&#39;ARN. Typiquement, en utilisant 500 ng d&#39;ARN pour cette procédure (tableau 3) et réaliser le procédé comme indiqué par le fabricant de l&#39;instrument et de détection. </li></ol>

<ol>
	<li>Schauer, I. G., Rowley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+role+of+reactive+stroma+in+benign+prostatic+hyperplasia.">The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia.</a> Differentiation. 82, 200-210 (2011).</li><li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+as+models+of+prostate+cancer+development.">Primary cell cultures as models of prostate cancer development.</a> Endocrine-related cancer. 12, 19-47 (2005).</li><li>McNeal, J. 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The authors have nothing to disclose.

Profil d&#39;expression génique à partir de spécimens humains peut être difficile, non seulement pour la qualité ou la quantité de tissus disponibles, mais aussi pour les différentes entités histologiques présents dans un échantillon de tissu donné. Cela est particulièrement difficile dans la prostate dans laquelle tissus bénins sont en grande partie des tissus et des domaines du cancer stromales sont dépourvues de stroma. LCM facilite la séparation physique de la prostate stroma et épithélium de l&#39;...

La prostate est un tissu hétérogène composée d&#39;épithélium sécrétoire disposé dans acini glandulaires entouré par stroma fibromusculaire composée principalement de muscle lisse 1. Le compartiment épithélial est composé de cinq différents types de cellules, mais organisés: cellules basales, les cellules sécrétoires, les cellules neuroendocrines, cellules amplificatrices de transit et les cellules souches 2. Dans cancer de la prostate (CaP), qui provient des cellules épithéliales luminales, la croissance de l&#39;adénocarcinome provoque une baisse progressive évidente du compartiment stromal 3. Pour ces raisons, les échantillons de tissus auront des différences distinctes dans la proportion et le type de stroma des cellules épithéliales en fonction de l&#39;étendue de la PCa. Ces différences peuvent conduire à des hypothèses biaisées des données d&#39;expression génique acquis à partir de tissus entiers sans égard à la microdissection du type de cellule souhaité. Par conséquent, pour éliminer ce biais, il est essentiel de séparer les types de cellules avant l&#39;extraction de l&#39;ARN etanalyse de l&#39;expression génique. Macrodissection microdissection ou peuvent être utilisés pour séparer physiquement les régions epitheliales bien caractérisés du stroma entourant 4 -6. Macrodissection est généralement fait avec une lame de rasoir sous un microscope de dissection et fonctionne bien pour séparer grande CaP nodules de stroma, mais ne sont pas capables d&#39;éliminer l&#39;épithélium bénin du stroma entourant (voir l&#39;exemple de bénigne de la prostate histologie à la figure 1). Microdissection avec un laser (LCM) est nettement plus de travail que macrodissection, mais peut disséquer de façon très précise l&#39;épithélium bénigne 4. Publications récentes de notre laboratoire ont montré que l&#39;ARN peut être extrait avec succès par LCM soit de paraffine (FFPE) biopsies fixés au formol ou tissu congelé 4,7-9. Les principaux défis dans l&#39;extraction LCM-ARN sont 1) de disséquer avec précision les zones souhaitées du tissu, et 2) de préserver RL&#39;intégrité NA 4,10 au cours de la processus de LCM et l&#39;isolement. ARN isolé à partir des populations de cellules pures peut être utilisé pour l&#39;analyse de l&#39;expression génique par plusieurs méthodes comprenant la transcription inverse-PCR quantitative (RT-qPCR) 7,8, microarray 11, et 12 à 14 -sequencing profond. L&#39;objectif de ce protocole est d&#39;isoler l&#39;ARN total de LCM prostate épithélium du tissu congelé pour analyse l&#39;expression des gènes en aval.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RNase-AWAY&#160;</td>
			<td>MBP</td>
			<td>7005-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN-membrane 4,0 mm slides&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11600289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides, Superfrost Plus</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon labs.</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC (diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplins (Staining jar)</td>
			<td>IHCWORLD</td>
			<td>M900-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplins (Staining rack)</td>
			<td>IHCWORLD</td>
			<td>M905-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperio ScanScope</td>
			<td>Aperio(Leica)</td>
			<td>ScanScope&#174; CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>89640-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection System</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL Thin-walled Tubes for LCM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAqueous&#174;-Micro Total RNA Isolation Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1931</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>203301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA RT kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366597</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin stain&#160;</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3536-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y</td>
			<td>Richard Allan Scientific&#160;</td>
			<td>7111</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-capture microdissection of human prostatic epithelium for rna analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

Dans une étude précédente, nous avons démontré l&#39;utilisation de LCM pour recueillir des tissus épithéliaux et stromales de comparer le profil d&#39;expression par RT-PCR quantitative de l&#39;ARNm et microARN de tissus de la prostate et FFPE congelés provenant du même patient 4. LCM est chronophage, en particulier si grande quantité d&#39;ARN doivent être collectées pour l&#39;analyse de séquençage de nouvelle génération. Par conséquent, il est essentiel de garder à l&#39;espace de trava...

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Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

Laser-microdissection de la prostate humaine épithélium pour l&#39;analyse de l&#39;ARN

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

13.4K vues.  University of Illinois at Chicago. The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

Vidéo: Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions between vitreous substructures and the retina underlie several vitreoretinal diseases, including retinal tear and detachment, macular pucker, macular hole, age-related macular degeneration, vitreomacular traction, proliferative vitreoretinopathy, proliferative diabetic retinopathy, and inherited vitreoretinopathies. 1,2 The molecular composition of the vitreous substructures is not known. Since the vitreous body is transparent with limited surgical access, it has been difficult to study its substructures at the molecular level. We developed a method to separate and preserve these tissues for proteomic and biochemical analysis. The dissection technique in this experimental video shows how to isolate vitreous base, anterior hyaloid, vitreous core, and vitreous cortex from postmortem human eyes. One-dimensional SDS-PAGE analyses of each vitreous component showed that our dissection technique resulted in four unique protein profiles corresponding to each substructure of the human vitreous body. Identification of differentially compartmentalized proteins will reveal candidate molecules underlying various vitreoretinal diseases.

This video shows an effective technique for differentiating and dissecting the various semi-transparent structures of the human vitreous body in post mortem eyes.

Dissection de l&#39;homme des éléments du corps vitré de l&#39;analyse protéomique

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions ...

Recherche

Médecine

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocole amélioré pour la microdissection laser d&#39;îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Progress in prostate cancer research is severely limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems, which limit our ability to understand genetic and molecular events underlying prostate disease initiation. Toward developing better model systems for studying human prostate carcinogenesis, we and others have taken advantage of the unique pro-prostatic inductive potential of embryonic rodent prostate stroma, termed urogenital sinus mesenchyme (UGSM). When recombined with certain pluripotent cell populations such as embryonic stem cells, UGSM induces the formation of normal human prostate epithelia in a testosterone-dependent manner. Such a human model system can be used to investigate and experimentally test the ability of candidate prostate cancer susceptibility genes at an accelerated pace compared to typical rodent transgenic studies. Since Human embryonic stem cells (hESCs) can be genetically modified in culture using inducible gene expression or siRNA knock-down vectors prior to tissue recombination, such a model facilitates testing the functional consequences of genes, or combinations of genes, which are thought to promote or prevent carcinogenesis.
The technique of isolating pure populations of UGSM cells, however, is challenging and learning often requires someone with previous expertise to personally teach. Moreover, inoculation of cell mixtures under the renal capsule of an immunocompromised host can be technically challenging. Here we outline and illustrate proper isolation of UGSM from rodent embryos and renal capsule implantation of tissue mixtures to form human prostate epithelium. Such an approach, at its current stage, requires in vivo xenografting of embryonic stem cells; future applications could potentially include in vitro gland formation or the use of induced pluripotent stem cell populations (iPSCs).

To unravel the earliest molecular mechanisms underlying prostate cancer initiation, novel and innovative human model systems and approaches are desperately needed. The potential of pre-prostatic urogenital sinus mesenchyme (UGSM) to induce pluripotent stem cell populations to form human prostate epithelium is a powerful experimental tool in prostate research.

Formation de l&#39;épithélium de la prostate humaine utilisant la recombinaison des tissus de rongeurs urogénital Mesenchyme des sinus et des cellules souches humaines

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

New therapies for two common prostate diseases, prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend critically on experiments evaluating their hormonal regulation. Sex steroid hormones (notably androgens and estrogens) are important in PrCa and BPH; we probe their respective roles in inducing prostate growth and carcinogenesis in mice with experiments using compressed hormone pellets. Hormone and/or drug pellets are easily manufactured with a pellet press, and surgically implanted into the subcutaneous tissue of the male mouse host. We also describe a protocol for the evaluation of hormonal carcinogenesis by combining subcutaneous hormone pellet implantation with xenografting of prostate cell recombinants under the renal capsule of immunocompromised mice. Moreover, subcutaneous hormone pellet implantation, in combination with renal capsule xenografting of BPH tissue, is useful to better understand hormonal regulation of benign prostate growth, and to test new therapies targeting sex steroid hormone pathways.

We describe the manufacture of compressed hormone pellets, as well as subcutaneous surgical implantation into mice. This strategy can be combined with the growth of cell and tissue xenografts under the renal capsule of athymic nude mice to evaluate hormonal carcinogenesis and regulation of benign prostate growth.

Rénale Capsule xénogreffe sous-cutanée et Pellet implantation pour l&#39;évaluation de la carcinogenèse prostatique et l&#39;hyperplasie prostatique bénigne

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

Étudier le diabète à travers les yeux d’un poisson : Microdissection, la visualisation et l’analyse de le tg(fli:EGFP) adulte vascularisation rétinienne de poisson-zèbre

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Surgical Treatment for Benign Prostatic Hyperplasia: Holmium Laser Enucleation of the Prostate (HoLEP).

Benign prostatic hyperplasia (BPH) commonly occurs among elderly males. The condition causes symptoms in the lower urinary tract, thereby reducing the quality of life. BPH includes 2 major treatments: medication and surgery. Surgical treatment is often the most effective and final intervention. Holmium laser enucleation of the prostate (HoLEP), one of the most efficient surgical procedures for BPH, is conducted transurethrally. During surgery, the most important and most difficult part is to locate the surgical capsule of the prostate, which is consistent to the idea of anatomic surgery. Different skills may be needed in treating different parts of the prostate. HoLEP tends to be efficient and safe with good hemostatic properties, and able to treat bladder calculus, which may be the complications of BPH. The technique is particularly suitable for prostate of varying volumes and sizes. Indeed, HoLEP also presents certain disadvantages, such as a long learning curve and costly equipment. Regardless, this method may be the "new standard" and the excellent method for the surgical treatment of BPH.

Surgical Treatment for Benign Prostatic Hyperplasia: Holmium Laser Enucleation of the Prostate HoLEP.

Here we present a safe and efficient protocol, holmium laser enucleation of the prostate, to treat benign prostatic hyperplasia.

Traitement chirurgical de l’hyperplasie bénigne de la prostate : énucléation Laser Holmium de la Prostate (HoLEP).

Benign prostatic hyperplasia (BPH) commonly occurs among elderly males. The condition causes symptoms in the lower urinary tract, thereby reducing the ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel therapeutics are urgently required. The ability of dosed TB drugs to reach and sterilize bacteria within poorly-vascularized necrotic regions (caseum) of pulmonary granulomas is crucial for successful therapeutic intervention. Effective therapeutic regimens must therefore contain drugs with favorable caseum penetration properties. Current LC/MS methods for quantifying drug levels in biological tissues have limited spatial resolution capabilities, making it difficult to accurately determine absolute drug concentrations within small tissue compartments such as those found within necrotic granulomas. Here we present a protocol combining laser capture microdissection (LCM) of pathologically-distinct tissue regions with LC/MS quantification. This technique provides absolute quantification of drugs within granuloma caseum, surrounding cellular lesion and uninvolved lung tissue and, therefore, accurately determines whether bactericidal concentrations are being achieved. In addition to tuberculosis research, the technique has many potential applications for spatially-resolved quantification of drugs in diseased tissues.

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Here, we describe a protocol using laser capture microdissection coupled with LC/MS analysis to spatially-quantify drug distributions within pulmonary tuberculosis granulomas. The approach has broad applicability to quantifying drug concentrations within tissues at high spatial detail.

Quantification spatiale des drogues dans les lésions de la tuberculose pulmonaire par Laser capturer Microdissection liquide chromatographie en spectrométrie de masse (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a promising therapeutic target in many disorders, such as autoimmune diseases, atherosclerosis, and cancer. RNAi-mediated gene silencing is a valuable approach of choice to probe and manipulate macrophage function; however, the transfection of macrophages with siRNA is often considered to be technically challenging, and, at present, few methodologies dedicated to the siRNA transfer to macrophages are available. Here, we present a protocol of using polyethyleneimine-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (PEI-SPIONs) as a vehicle for the targeted delivery of siRNA to macrophages. PEI-SPIONs are capable of binding and completely condensing siRNA when the Fe:siRNA weight ratio reaches 4 and above. In vitro, these nanoparticles can efficiently deliver siRNA into primary macrophages, as well as into the macrophage-like RAW 264.7 cell line, without compromising cell viability at the optimal dose for transfection, and, ultimately, they induce siRNA-mediated target gene silencing. Apart from being used for in vitro siRNA transfection, PEI-SPIONs are also a promising tool for delivering siRNA to macrophages in vivo. In view of its combined features of magnetic property and gene-silencing ability, systemically administered PEI-SPION/siRNA particles are expected not only to modulate macrophage function but also to enable macrophages to be imaged and tracked. In essence, PEI-SPIONs represent a simple, safe, and effective nonviral platform for siRNA delivery to macrophages both in vitro and in vivo.

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

We describe a method of using polyethyleneimine (PEI)-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles for transfecting macrophages with siRNA. These nanoparticles can efficiently deliver siRNA to macrophages in vitro and in vivo and silence target gene expression.

Nanoparticules de Polyéthylèneimine recouvertes d’oxyde de fer comme un véhicule pour la livraison de petits ARN interférents à Macrophages In Vitro et In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release different bioactive molecules that control metabolic, hormonal, and immune processes; currently, it is unclear how these processes are regulated within the adipose tissue. Therefore, the development of methods evaluating the contribution of each cell population to the pathophysiology of adipose tissue is crucial. This protocol describes the isolation steps and provides the necessary troubleshooting guidelines for efficient isolation of viable mature adipocytes and SVF from human VAT biopsies in a single process, using a collagenase enzymatic digestion technique. Moreover, the protocol is also optimized to identify macrophage subsets and perform mature adipocyte RNA isolation for gene expression studies, which allows performing studies dissecting the interaction between these cell populations. Briefly, VAT biopsies are washed, minced mechanically, and digested to generate a single-cell suspension. After centrifugation, mature adipocytes are isolated by flotation from the SVF pellet. The RNA extraction protocol ensures a high yield of total RNA (including miRNAs) from adipocytes for downstream expression assays. Simultaneously, SVF cells are used to characterize macrophage subsets (pro- and anti-inflammatory phenotype) through flow cytometry analysis.

This protocol provides an efficient collagenase digestion method for isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction-SVF cells from human visceral fat in a single process, including methodology to obtain high-quality RNA from adipocytes and phenotypification of SVF-macrophages through staining of multiple membrane-bound markers for analysis by flow cytometry.

Isolement d’adipocytes viables et d’une fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux viscéral humain adapté à l’analyse de l’ARN et au phénotypage des macrophages

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

Transplantation d’épithélium pigmentaire rétinien dans un modèle de primate non humain pour les maladies dégénératives de la rétine

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...