Name: laser-capture microdissection of human prostatic epithelium for rna analysis
Uploaded: 2015-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
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We thank Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco and Avani Vaishnav for assistance with optimizing this methodology over the years and Yang Zhang and Dr. Jian Ma at the University of Illinois at Urbana-Champaign for the RNA seq analysis. This work was supported by NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) and a Prevent Cancer Foundation grant (Zhou).

これらの実験に使用したすべてのヒト組織は、シカゴのイリノイ大学の治験審査委員会承認されたプロトコルおよび/または免除を介して取得されました。 1.第新鮮凍結前立腺PEN-スライドへと荷電スライドガラス上に<ol><li>一日前または数時間サンプルを切片化する前に、きれいなツール（ すなわち、ブラシ、ピンセット、coplins、ブレード、PEN-枠スライド（いない場合は、すでにRNaseを含まない）、ETOH安全マーカーや鉛筆）との内部スプレーボトルとラボワイプを使用して、RNaseを除染液を用いたRTクライオスタット。 <ol><li> RNaseを除染液および70％エタノール（depcH 2 0を用いて調製）との最後のすすぎの上に左を削除するには、depcH 2 0で洗い流し、RNaseを除染液は拭き取る前に5分間静置します。 注：これは、RNaseフリーワークスペースを維持することが不可欠です。すべてcoplins、ツール、冷凍封入、ブレードおよび使用スライドはRNaseを含まない仕事のためにのみ使用する必要がありますそして、標準的な非RNaseを含まない環境で使用されることはありません。すべての機器は、各実験の前のRNase汚染除去溶液で処理する必要があります。 </li></ol></li><li> -24℃に冷却し、クライオスタット。 </li><li>スライド100％エタノール、ツール、小さな凍結組織カセットと装着チャックでコプリンに満ちた：前の切片に少なくとも30分を冷却するクライオスタット内部で、次の洗浄のRNaseフリーの器具を配置します。 </li><li>輸送のためにドライアイスを充填した発泡バケットに凍結保存し、場所から凍結した前立腺組織を取得します。少なくとも30分間温度をクライオスタット平衡にクライオスタットに組織を配置します。 注：レーザーキャプチャーマイクロダイセクションのためのヒト前立腺組織は、新鮮凍結、またはホルマリン固定のいずれかパラフィン包埋（FFPE）することができます。時間の制約とスライドの準備は、組織源との間にわずかに異なります。ここでは、凍結切片のための手順を説明します。 </li><li>一度に一つの組織と協力し、だぼっに凍結された封入剤を噴出カセットのMとすぐには冷えた鉗子を使用して凍結されたマウンティング培地中に凍結された前立腺組織をマウントします。 </li><li>凍結されたマウンティング培地を設定するために5分間クライオスタット内チラーに組織にカセットを置きます。 </li><li>チャック上に凍結された封入剤を少量噴出し、慎重に凍結されたマウンティング培地上に取り付けられた組織下側を押してください。 5分が凍結された封入剤が完全に固化することを可能にするためのクライオスタットに設定してみましょう。 </li><li>ホルダーにチャックを配置し、締めます。 </li><li>ロックされた位置でハンドルをロックし、クライオスタットに新しいブレードを配置します。増幅工程（ すなわち、定量PCR）を含む下流分子のエンドポイントの場合には、汚染を防止する（または次のサンプルに対して、ブレードの面積を使用するように刃を上に移動）するために、各患者のための新しいブレードを使用することをお勧めします。 </li><li>ハンドルのロックを解除し、慎重にしても、50μで組織を露出させるために手またはフットペダルで組織を進めます所望の組織の曝露までメートル部に到達します。 </li><li> 5μmのクライオスタットを調整し、一つまたは二つの部分を切断して（ステップ2を参照）、ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）染色するための荷電スライドガラス上に配置します。 </li><li>すぐに2分間の冷100％エタノールにスライドを配置します。 </li><li>エタノールから充電スライドガラスを削除し、H＆E染色（ステップ2）に進む前に、室温でそれが乾燥してみましょう。 </li><li>フレームサポーターにRT PEN-フレームスライドを置きます。 </li><li> RT PENフレームスライド上に10ミクロンと場所のセクションにクライオスタットを調整します。四つの部分の一つは、組織の大きさに応じて、各スライド上の場所であることができます。 </li><li>すぐに2分間の冷100％エタノールにスライドを突入。 </li><li>エタノールからPEN-フレームスライドを削除し、LCMの準備ができるまで-80℃の冷凍庫にデシケーターボックス内でスライドボックスでスライドを保存します。三日後、最適なRNAの回収の最大蓄積時間です。 </li><li>充電ガラスがスライドのみステップ2に進んでくださいE。 PEN-フレームスライドのステップ3に進みます。 </li></ol> 2.ヘマトキシリン​​およびエオシンY（H＆E）組織学的マークアップのための染色注：この充電スライドガラス上の組織およびNOT LCMのためのPEN-フレームスライドの場合。 <ol><li>以下のように段階的エタノールを通してスライドを浸漬荷電したガラススライド上に切片を水和：3分間二、70％エタノール中で一回、3分間、3分間、スライドを95％エタノールで2回、100％エタノールで2回浸し3分間蒸留H 2 Oで倍。 <ol><li> 99 mlの70％エタノール+ 1 mlの1％HClおよび0.1％重炭酸ナトリウム溶液：H 2 Oを100mlの蒸留中に0.1グラムの炭酸水素ナトリウム酸アルコール溶液を調製します</li></ol></li><li> 5分間ヘマトキシリン​​ギルII（0.4％）でスライドを浸し。 </li><li> 3分間定常走行タップH 2 O中の過剰な汚れを洗い流します。 </li><li>酸アルコールでスライドを10回浸し</li><li> 3分間水道H 2 Oを実行するには、スライドを洗浄します。 </li><li>スライドを浸し青紫に色をオンに30~60秒間0.1％重炭酸ナトリウム溶液です。 </li><li> 3分間水道H 2 Oを実行するには、スライドを洗浄します。 </li><li> 10ディップで、95％エタノールでスライドを洗浄します。 </li><li> 15秒の合計エオシン-Y 2-3回でスライドを浸し。 </li><li>次のように段階的エタノールを通してスライドを脱水：キシレンにスライドを95％エタノールで2回、100％エタノールで2回、そして2回浸し（組織は徹底的に脱水を示した明確な表示されますことを確認してください）​​。 </li><li>非水性永久ハード封入し、カバースリップでスライドをマウントします。 </li><li> 30分間スライドを乾燥させてください。 </li><li>任意の整数のスライドスキャナでスキャンスライドとは、8 &quot;×11&quot;紙の上に大きな、高解像度の画像を印刷します。 </li><li>興味の概要エリアがマーカーで（一般的にボード認定病理学者によって行われます）。このマークアップは、LCMの手続きのためのガイドです。 </li></ol> PEN-フレームスライドの3トルイジンブルー染色注：番目LCMと同じ日に行われています。すべてのソリューションをdepcH 2 O水を使用してください。 RNaseフリーエリア内のすべての手順を実行します。すべてcoplinsはRNaseを除染液で洗浄しなければなりません。 <ol><li> LCMの日は2分間、その後2分間90％エタノールに静かに浸漬スライドすることにより、75％エタノールを-80℃の冷凍庫や水和物からPEN-フレームスライドを削除します。 <ol><li>その後、室温で0.2μmのフィルターとストアを介して滅菌フィルタ分子生物学グレードの水に溶解して0.5％のトルイジンブルーを用意。この溶液を6ヶ月までに再利用することができます。注：それは非常濾過の前に数時間かかることがありますように溶液を調製することをお勧めします。 </li></ol></li><li>静かに5-30秒間0.5％トルイジンブルーにスライドを浸漬することにより、前立腺組織を染色します。 3分30秒75％エタノール、続いて15秒間の洗浄スライドによる組織depcH 2 Oで2回脱色。注：染色及び脱色時間は、良好な染色性を確保するように調整することができます。前立腺は、汚れを超える傾向にあります。 </li><li&gt;は氷の上でRNA分解酵素を含まないドライコンテナにPEN-フレームスライドを転送します。 </li></ol> 4.レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM） <ol><li> LCM、15分間42℃で暖かいスライド上の乾燥したスライドの直前に。それらの準備ができるまで処理され、氷の上に残りの部分を保存するだけでスライドドライ。 </li><li> LCMとコンピュータの順に、顕微鏡パワー、レーザーキー、レーザースイッチしてから、コンピュータの電源をオンにします。レーザーマイクロダイセクションのソフトウェアを起動します。 </li><li>スライドとコレクションチューブをロードするために顕微鏡を制御するためのソフトウェアを使用してください。その後、「続ける」をクリックし、「アンロードサンプルホルダー」をクリックして下に向けて組織を顕微鏡のスライドホルダーにセクションを含むスライドをロードし、顕微鏡での適切なスロットにスライドホルダーを挿入します。 <ol><li> 「コレクションチューブをアンロード」、ラベルをクリックして、チューブホルダーに0.5ミリリットルチューブをロードし、機器内の適切なスロットに挿入します。一度キャップは、収集キャップに溶解緩衝液の35μlを添加し、気泡を回避しようと、固定されています。その後、「OK」をクリックします。 注意：25μlの溶解バッファーを10μlのdepcH2Oで：蒸発は問題がある場合は、次のようにバッファーを希釈します。 </li></ol></li><li>ソフトウェアでは、スライドは、スライドホルダーに置かれている位置を選択します。 LCM標本を収集するために、コレクションキャップを選択します。 </li><li>視覚化し、10Xでコンピュータを介してスライドを集中。その後、「キャリブレーション」「レーザー」を選択することで、レーザーを校正するためのソフトウェアを使用してください。完全にかつ効率的に選択した領域をカットするレーザービームを可能にするために、次に「コントロール」の「レーザー」を選択、レーザーのパワー、絞りと速度を調整します。完全に組織を通るレーザーカットまで調整を繰り返します。 </li><li>ガイドとして8 &quot;×11&quot;病理学者のマークアップを使用して、epitheの所望の領域に外接する「図形を描画」ツールを使用しますビューのliumとは、任意の間質を収集しないようにしてください。 複数の領域を1つのビュー内で選択することができますが、「形をカット」ツールをクリックすることで、第一の切断することなく、別のビューに移動しません。注意して​​ください。 <ol><li>領域が完全にレーザーでカットされない場合は、手動でその上に行くために「移動とカット」ツールを使用します。新しいビューに目標を移動する続け、スライドが完全に切開されるか、または組織の所望の量が収集されるまで、レーザー切断を繰り返す（一般的に100良性腺の150〜500 ngのRNAをもたらします）。 （ 図1Aの例を参照）。 </li></ol></li><li>慎重に収集ホルダーからチューブを外し、キャップを閉じ、キャップに溶解バッファーと組織の意識です。簡単に説明すると、チューブの底に液体や組織を収集するために30秒間遠心します。 RNA単離のための準備ができるまで-80℃で30分間、店舗、42℃でサンプルをインキュベートします。 </li></ol>フィル5.全RNA単離ターベースキットと品質分析<ol><li>氷の上にチューブを解凍し、100μlに溶液の体積をもたらします。 </li><li>フィルタの中心に30μlのofLysisソリューションを適用することにより、RNA単離キットのミクロフィルターを事前に濡らし、それは次の2つの手順（最低5分）whileperforming浸すことができます。 </li><li>溶解液に（キットに付属）LCM添加剤溶液3μLを加え、5秒間ボルテックスで混和します。チューブの底に液体を収集するために30秒間遠心分離。 </li><li>遠心液体を除去するためにトップスピードで〜30秒間予め湿らせたフィルター。 </li><li>軽くボルテックスまたはピペット上下、溶解液の混合物に、100％エタノールの1.25容量（この場合は129μl）を追加します。 **このメソッドは、大小両方のRNA種を回復します。 </li><li>フィルターにRNAに結合する予め湿潤ミクロフィルター、および1分間万×gで遠心分離器にサンプルをロードします。その後、洗浄溶液1、R」の180μlのマイクロフィルターを洗います21; 1分間万×gで遠心します。 注：すべての遠心分離で、この点は13,000×gで、または最高速度で実行する必要がありますから。 </li><li>キットのプロトコールによって指示としてそれぞれ、「洗浄溶液2および3」の180μlの二回フィルターを洗浄してください。 30秒間遠心し、フロースルーを廃棄し、残留液を除去し、フィルターを乾燥させるために1分間スピンフィルター。 </li><li>新しいコレクションチューブにフィルターを転送します。 </li><li> （キットに付属）-95°Cに暖かい溶出溶液。 </li><li>フィルタの中心に予熱し、溶出溶液10μlを適用し、キャップを閉め、室温で5分間保存します。その後、RNAを溶出するために1分間遠心し、RNAの〜20μLを得、この手順を一度繰り返します。 </li><li> 37℃で15分間のDNase I処理を行います。 </li><li> 260 nmの吸光度を分光光度計により、RNAを定量化します。 260 nmおよび280 nmの波長での光学密度の比率は、純度を評価するために使用されRNA（ 表1参照）15。 </li></ol> 6.遺伝子発現解析注：（mRNAおよびlncRNAsのような）長いRNA種の遺伝子発現は、ステップ6.1に示されており、（マイクロRNAのような）短いRNA種は、ステップ6.2に示されています。別のキットは、RT-qPCRのために利用可能であり、必要なRNAの量は、（10 ngのはわずか）キットによって異なります。 RNAの配列決定分析は、6.3に記載されています。 <ol><li>リバース議事録（RT）RTマスターミックス5μlの（RTバッファー、dNTPを、ランダムプライマー、RT酵素、RNase阻害剤）と20 ngの/μlのRNAサンプルの5μLを混合するcDNAへのRNA。 37℃で120分間、その後、25℃で25分間、反応をインキュベートし、85℃で5分間。 </li><li> RNaseを含まない水を用いてRT反応1:10に希釈し、目的の遺伝子のためのプライマーまたはプライマー/プローブセットを用いて10μlの定量PCR反応あたり2.5μlのを使用しています。 注意：部分的に分解されたRNAの解析を容易にするためにそれはfoのプライマーを使用することをお勧めしますR短いアンプリコン（100bp未満）16。（表2B） <ol><li>マイクロRNA発現解析のために2-10 NG / RTマスターミックスの5μlのμlのRNAサンプルの5μLを混合することによって、RT反応を実行します。 注意：それぞれの市販のPCRベースのマイクロRNA検出技術は、独自か​​つ特異的RTプライマーの使用を必要とします。 </li></ol></li><li>あるいは、またはRT-PCRに加えて、RNAの異なる種を定量化するために、次世代シーケンシング（RNA-seqのか小RNA-seqの）を使用します。製造業者および検出機器によって示されるように、典型的には、この手順（表3）のために500ngのRNAを使用し、方法を実施します。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

人間の標本から遺伝子発現プロファイリングは、利用可能な組織の品質や数量のでなく、与えられた組織標本に存在する様々な組織学的実体のためだけではなく、挑戦することができます。これは、良性組織が大きく、間質組織および癌の領域である間質を欠いていた前立腺では特に困難です。 LCMは、2つの異なる細胞タイプ（ 図1A）のより正確な署名のための前立腺間質および...

前立腺は、主に平滑筋1で構成される線維筋間質に囲まれた腺房に配置された分泌上皮で構成される異種の組織です。基底細胞、分泌細胞、神経内分泌細胞、トランジット増幅細胞と幹細胞の2：上皮の区画は、5つの異なるが、組織的な細胞型で構成されています。管腔の上皮細胞から生じる前立腺癌（PCA）では、腺癌の成長は、間質コンパートメント3の明白な進行性の低下の原因となります。これらの理由のために、組織標本は、PCaの程度に基づいて、間質および上皮細胞型の割合の明確な違いがあります。これらの差異は、所望の細胞型の顕微解剖に関係なく、全体の組織から取得した遺伝子発現データのバイアスされた仮定を導くことができます。したがって、このバイアスを除去するために、RNA抽出前に別個の細胞型に必須であると遺伝子発現解析。 Macrodissectionまたは顕微解剖は、物理的に周囲の間質4 -6から十分に特徴付け上皮領域を分離するために使用することができます。 Macrodissectionは通常、解剖顕微鏡下でのかみそりの刃で行われ、大規模なPCAが間質から結節分離に適していますが、間質を取り巻くから良性の上皮を除去することができるではありません（ 図1の良性前立腺組織像の例を参照）。レーザー（LCM）と顕微解剖はmacrodissectionよりもはるかに多くの労働集約的であるが、非常に正確に良性の上皮4を分析することができます。 我々の研究室からの最近の刊行物は、RNAが正常にホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）生検または凍結組織4,7-9のいずれかからLCMによって抽出することができることを示しています。 LCM-RNA抽出の主要な課題は1である）を正確に組織の所望の領域を分析するため、及び2）Rを保存しますLCMおよび分離プロセス4,10の間に整合性NA。純粋な細胞集団から単離したRNAを逆転写定量的PCR（RT-qPCRの）7,8、マイクロアレイ11、及び深い-sequencing 12-14を含むいくつかの方法によって、遺伝子発現解析のために使用することができます。 このプロトコルの目的は、下流の遺伝子発現分析のために凍結した組織からのLCMの前立腺上皮からの全RNAを単離することです。

<table><tbody><tr><td>RNase-AWAY&amp;nbsp;</td><td>MBP</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>PEN-membrane 4.0 mm slides&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>11600289</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides, Superfrost Plus</td><td>FisherBrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>Decon labs.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>DEPC (diethyl pyrocarbonate)</td><td>Sigma</td><td>D-5758</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Coplins (Staining jar)</td><td>IHCWORLD</td><td>M900-12</td><td></td></tr><tr><td>Coplins (Staining rack)</td><td>IHCWORLD</td><td>M905-12</td><td></td></tr><tr><td>Aperio ScanScope</td><td>Aperio(Leica)</td><td>ScanScope&amp;reg; CS</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue</td><td>Fluka</td><td>89640-5G</td><td></td></tr><tr><td>Laser Microdissection System</td><td>Leica</td><td>LMD7000</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml Thin-walled Tubes for LCM</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0350</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous&amp;reg;-Micro Total RNA Isolation Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q32866</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand</td></tr><tr><td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand</td></tr><tr><td>Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns</td><td>Exiqon</td><td>203301</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan microRNA RT kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366597</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand</td></tr><tr><td>Hematoxylin stain&amp;nbsp;</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3536-16</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Y</td><td>Richard Allan Scientific&amp;nbsp;</td><td>7111</td><td></td></tr></tbody></table>

laser-capture microdissection of human prostatic epithelium for rna analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

以前の研究では、同じ患者4から凍結しFFPE前立腺組織からmRNAおよびマイクロRNAのRT-qPCRにより発現プロファイリングを比較する上皮および間質組織を収集するためのLCMの使用を実証しました。 LCMは、RNAの大量次世代配列決定分析のために収集される場合は特に、時間がかかります。そのため、作業スペースを維持するために重要であり、ツールは、RNaseフリー。これは、（次の段落で?...

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Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

RNA分析のためのヒト前立腺上皮のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

13.4K ビュー.  University of Illinois at Chicago. The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

ビデオ: Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

定量的リアルタイムPCR（定量PCR）による前立腺腫瘍におけるマイクロRNAの検出

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

医学

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results in cancer regression. However, in a significant number of cases, the disease progresses to advanced, castration-resistant prostate cancer (CRPC), which has limited therapeutic options and is often aggressive. Distant metastasis is mostly observed at this stage of the aggressive disease. CRPC is treated by a second generation of AR pathway inhibitors that improve survival initially, followed by the emergence of therapy resistance. Neuroendocrine prostate cancer (NEPC) is a rare variant of prostate cancer (PCa) that often develops as a result of therapy resistance via a transdifferentiation process known as neuroendocrine differentiation (NED), wherein PCa cells undergo a lineage switch from adenocarcinomas and show increased expression of neuroendocrine (NE) lineage markers. In addition to the genomic alterations that drive the progression and transdifferentiation to NEPC, epigenetic factors and microenvironmental cues are considered essential players in driving disease progression. This manuscript provides a detailed protocol to identify the epigenetic drivers (i.e., small non-coding RNAs) that are associated with advanced PCa. Using purified microRNAs from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) metastatic tissues and corresponding serum-derived extracellular vesicles (EVs), the protocol describes how to prepare libraries with appropriate quality control for sequencing microRNAs from these sample sources. Isolating RNA from both FFPE and EVs is often challenging because most of it is either degraded or is limited in quantity. This protocol will elaborate on different methods to optimize the RNA inputs and cDNA libraries to yield most specific reads and high-quality data upon sequencing.

Therapy resistance often develops in patients with advanced prostate cancer, and in some cases, cancer progresses to a lethal subtype called neuroendocrine prostate cancer. Assessing the small non-coding RNA-mediated molecular changes that facilitate this transition would allow better disease stratification and identification of causal mechanisms that lead to development of neuroendocrine prostate cancer.

去勢耐性前立腺癌患者からのホルマリン固定組織および血清由来エキソソームからの小型非コードRNAのシーケンシング

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

がん研究

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, particularly in low dosage values1&#8203;&#8203;. &#8216;How to use PSA&#39; remains a current issue, either for diagnosis as a gray zone corresponding to a concentration in serum of 2.5-10 ng/ml which does not allow a clear differentiation to be made between cancer and noncancer2 or for patient follow-up as analysis of post-operative PSA kinetic parameters can pose considerable challenges for their practical application3,4. Alternatively, noncoding RNAs (ncRNAs) are emerging as key molecules in human cancer, with the potential to serve as novel markers of disease, e.g. PCA3 in prostate cancer5,6 and to reveal uncharacterized aspects of tumor biology. Moreover, data from the ENCODE project published in 2012 showed that different RNA types cover about 62% of the genome. It also appears that the amount of transcriptional regulatory motifs is at least 4.5x higher than the one corresponding to protein-coding exons. Thus, long terminal repeats (LTRs) of human endogenous retroviruses (HERVs) constitute a wide range of putative/candidate transcriptional regulatory sequences, as it is their primary function in infectious retroviruses. HERVs, which are spread throughout the human genome, originate from ancestral and independent infections within the germ line, followed by copy-paste propagation processes and leading to multicopy families occupying 8% of the human genome (note that exons span 2% of our genome). Some HERV loci still express proteins that have been associated with several pathologies including cancer7-10. We have designed a high-density microarray, in Affymetrix format, aiming to optimally characterize individual HERV loci expression, in order to better understand whether they can be active, if they drive ncRNA transcription or modulate coding gene expression. This tool has been applied in the prostate cancer field (Figure 1).

Human endogenous retroviruses (HERV), which occupy 8% of the human genome, retain scarce coding capacities but a hundred thousand long terminal repeats (LTRs). A custom Affymetrix microarray was designed to identify individual HERV locus expression and was used on prostate cancer tissues as a proof of concept for future clinical studies.

前立腺癌におけるバイオマーカーの発見への応用：個々のHERV座発現のマイクロアレイベースの識別

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

遺伝子発現解析のためのマウス胚軟骨と骨のレーザー捕捉微小分片

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

発生生物学

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, diagnosis, prognosis and treatment. In recent years, microRNAs (miRNAs) have emerged as promising alternate biomarkers for prostate cancer diagnosis and prognosis. However, the development of miRNAs as effective biomarkers for prostate cancer heavily relies on their accurate detection in clinical tissues. miRNA analyses in prostate cancer clinical specimens is often challenging owing to tumor heterogeneity, sampling errors, stromal contamination etc. The goal of this article is to describe a simplified workflow for miRNA analyses in archived FFPE or fresh frozen prostate cancer clinical specimens using a combination of quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH). Within this workflow, we optimize the existing methodologies for miRNA extraction from FFPE and frozen prostate tissues and expression analyses by Taqman-probe based miRNA RT-PCR. In addition, we describe an optimized method for ISH analyses formiRNA detection in prostate tissues using locked nucleic acid (LNA)- based probes. Our optimized miRNA ISH protocol can be applied to prostate cancer tissue slides or prostate cancer tissue microarrays (TMA).

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

前立腺癌臨床組織におけるmiRNA発現解析

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

新鮮凍結ひと組織から腸管神経節の隔離のためのレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクションの最適化

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

神経科学

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires precise identification of cells subpopulations from a heterogeneous tissue. Identification of cells of interest for LCM is usually based on morphological criteria or on fluorescent protein reporters. The combination of LCM and rapid immunolabeling offers an alternative and efficient means to visualize specific cell types and to isolate them from surrounding tissue. High-quality RNA can then be extracted from a pure cell population and further processed for downstream applications, including RNA-sequencing, microarray or qRT-PCR. This approach has been previously performed and briefly described in few publications. The goal of this article is to illustrate how to perform rapid immunolabeling of a cell population while keeping RNA integrity, and how to isolate these specific cells using LCM. Herein, we illustrated this multi-step procedure by immunolabeling and capturing dopaminergic cells in brain tissue from one-day-old mice. We highlight key critical steps that deserve special consideration. This protocol can be adapted to a variety of tissues and cells of interest. Researchers from different fields will likely benefit from the demonstration of this approach.

Gene expression analysis of a subset of cells in a specific tissue represents a major challenge. This article describes how to isolate high-quality total RNA from a specific cell population by combining a rapid immunolabeling method with laser capture microdissection.

迅速な免疫標識と合わせてレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用して、細胞特異的な亜集団からのRNAの単離

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

生物学

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

遺伝子発現解析のためのマウスの目から非常に純粋な小柱網のキャプチャ マイクロダイゼクション

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

新鮮な凍結マウスの骨から高品質のRNAを得るレーザー捕捉微解剖プロトコル

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and depth of this technology and extending it to the level of cells within the tissue is needed. Although the use of single nuclear and single cell RNA sequencing has become widespread, the expression signatures of cells obtained from tissue dissociation do not maintain spatial context. Laser microdissection (LMD) based on specific fluorescent markers would allow the isolation of specific structures and cell groups of interest with known localization, thereby enabling the acquisition of spatially-anchored transcriptomic signatures in kidney tissue. We have optimized an LMD methodology, guided by a rapid fluorescence-based stain, to isolate five distinct compartments within the human kidney and conduct subsequent RNA sequencing from valuable human kidney tissue specimens. We also present quality control parameters to enable the assessment of adequacy of the collected specimens. The workflow outlined in this manuscript shows the feasibility of this approach to isolate sub-segmental transcriptomic signatures with high confidence. The methodological approach presented here may also be applied to other tissue types with substitution of relevant antibody markers.

We describe a protocol for laser microdissection of sub-segments of the human kidney, including the glomerulus, proximal tubule, thick ascending limb, collecting duct and interstitium. The RNA is then isolated from the obtained compartments and RNA sequencing is carried out to determine changes in the transcriptomic signature within each sub-segment.

ヒト腎臓組織における局所転写論を明らかにするレーザー微小解剖の応用

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...

RNA分析のためのヒト前立腺上皮のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

要約

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定量的リアルタイムPCR（定量PCR）による前立腺腫瘍におけるマイクロRNAの検出

去勢耐性前立腺癌患者からのホルマリン固定組織および血清由来エキソソームからの小型非コードRNAのシーケンシング

前立腺癌におけるバイオマーカーの発見への応用：個々のHERV座発現のマイクロアレイベースの識別

遺伝子発現解析のためのマウス胚軟骨と骨のレーザー捕捉微小分片

前立腺癌臨床組織におけるmiRNA発現解析

新鮮凍結ひと組織から腸管神経節の隔離のためのレーザーキャプチャレーザーマイクロダイセクションの最適化

迅速な免疫標識と合わせてレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用して、細胞特異的な亜集団からのRNAの単離

遺伝子発現解析のためのマウスの目から非常に純粋な小柱網のキャプチャマイクロダイゼクション

新鮮な凍結マウスの骨から高品質のRNAを得るレーザー捕捉微解剖プロトコル

ヒト腎臓組織における局所転写論を明らかにするレーザー微小解剖の応用

RNA分析のためのヒト前立腺上皮のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

要約

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定量的リアルタイムPCR（定量PCR）による前立腺腫瘍におけるマイクロRNAの検出

去勢耐性前立腺癌患者からのホルマリン固定組織および血清由来エキソソームからの小型非コードRNAのシーケンシング

前立腺癌におけるバイオマーカーの発見への応用：個々のHERV座発現のマイクロアレイベースの識別

遺伝子発現解析のためのマウス胚軟骨と骨のレーザー捕捉微小分片

前立腺癌臨床組織におけるmiRNA発現解析

新鮮凍結ひと組織から腸管神経節の隔離のためのレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクションの最適化

迅速な免疫標識と合わせてレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用して、細胞特異的な亜集団からのRNAの単離

遺伝子発現解析のためのマウスの目から非常に純粋な小柱網のキャプチャ マイクロダイゼクション

新鮮な凍結マウスの骨から高品質のRNAを得るレーザー捕捉微解剖プロトコル

ヒト腎臓組織における局所転写論を明らかにするレーザー微小解剖の応用

新鮮凍結ひと組織から腸管神経節の隔離のためのレーザーキャプチャレーザーマイクロダイセクションの最適化

遺伝子発現解析のためのマウスの目から非常に純粋な小柱網のキャプチャマイクロダイゼクション