We thank Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco and Avani Vaishnav for assistance with optimizing this methodology over the years and Yang Zhang and Dr. Jian Ma at the University of Illinois at Urbana-Champaign for the RNA seq analysis. This work was supported by NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) and a Prevent Cancer Foundation grant (Zhou).

이 실험에 사용 된 모든 인체 조직은 시카고 일리노이 대학의 임상 시험 심사위원회의 승인을 프로토콜 및 / 또는 면제를 통해 인수했다. 1. 제 냉동 전립선 PEN-슬라이드에와 충전 유리 슬라이드에 <ol><li> 하루 전 또는 몇 시간 샘플을 절편하기 전에, 청소 도구 (즉, 브러쉬, 집게, coplins, 블레이드, PEN-프레임 슬라이드 (그렇지 않으면 이미 된 RNase 무료), ETOH 안전 마커와 연필)과의 내부 스프레이 병 및 실험실 와이프를 사용하여 솔루션을-오염 제거의 RNase와 RT의 저온 유지 장치. <ol><li> 의 RNase-오염 제거 솔루션, 멀리 닦아 전에 5 분 동안 앉아 솔루션 (depcH 2 0 준비) 70 % EtOH로 최종 헹굼의 RNase가-오염 제거를 통해 왼쪽 제거하려면 depcH 2 0 씻어하도록 허용합니다. 참고 :이 된 RNase없는 작업 공간을 유지하기 위해 필수적이다. 모든 coplins, 도구, 냉동 장착 매체, 블레이드 및 사용 슬라이드의 RNase 무료 작업에만 사용되어야한다및 표준 비의 RNase없는 환경에서 사용되지 않습니다. 모든 악기는 각 실험 이전의 RNase의 오염 제거 용액으로 처리해야합니다. </li></ol></li><li> -24 ℃로 냉각 저온 유지 장치. </li><li> 이전 절편에 적어도 30 분을 냉각 저온 유지 장치 내부에 다음과 같은 청소의 RNase 무료로 악기를 배치 : 슬라이드 코 플린 충전 100 % 에탄올, 도구, 작은 냉동 조직 카세트 및 장착 척. </li><li> 전송을 위해 드라이 아이스로 채워진 거품 양동이에 cryostorage과 장소에서 냉동 된 전립선 조직을 검색합니다. 적어도 30 분 동안 온도를 저온 유지하는 평형 저온 유지로 조직을 놓습니다. 참고 : 레이저 캡처 마이크로 해부에 대한 인간의 전립선 조직이 신선한 냉동 또는 일 수있다 파라핀 (FFPE)를 포르말린 고정. 시간 제약 및 슬라이드 준비는 조직 소스간에 약간 다릅니다. 여기에서 우리는 냉동 섹션의 단계를 설명합니다. </li><li> 한 번에 하나의 조직과 협력하고 BOTTO에 고정 설치 매체를 분출카세트의 M 빠르게는 냉장 집게를 사용하여 냉동 설치 매체에 고정 된 전립선 조직을 탑재합니다. </li><li> 냉동 설치 매체를 설정하는 데 5 분 동안 저온 유지 장치에 냉각기에 조직과 카세트를 놓습니다. </li><li> 척에 고정 장착 매체의 작은 금액을 분출 조심스럽게 냉동 설치 매체에 최대 장착 조직 아래쪽을 누르십시오. 5 분은 냉동 장착 매체가 완전히 응고 할 수 있도록하기위한 저온 유지 장치에 설정할 수 있습니다. </li><li> 홀더에 척을 배치하고 조입니다. </li><li> 잠금 위치에 손잡이를 잠금 및 저온 유지 장치에 새로운 블레이드를 배치합니다. 증폭 단계를 포함 하류 분자 엔드 포인트의 경우 (즉, qPCR에)는 오염을 방지 (또는 다음 샘플을 위해 블레이드의 영역을 사용하는 동안 블레이드를 이동) 각 환자에 대한 새로운 블레이드를 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 핸들의 잠금을 해제하고 조심스럽게 균일 손 또는 발 페달과 조직을 발전 50 μ와 조직을 노출원하는 조직 m까지 노출 부에 도달한다. </li><li> 5 μm의 저온 유지 장치를 조정 하나 또는 두 개의 섹션을 절감하고 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E) 염색 부과 유리 슬라이드에 그들을 배치 (2 단계 참조). </li><li> 즉시 2 분 동안 차가운 100 % 에탄올로 슬라이드를 배치합니다. </li><li> 에탄올에서 충전 된 유리 슬라이드를 제거하고 H &amp; E 염색 (2 단계)로 진행하기 전에 실온에서이 건조 할 수 있습니다. </li><li> 프레임 지지자에 RT PEN 프레임 슬라이드를 놓습니다. </li><li> RT PEN 프레임 슬라이드에 10 μm의 장소 섹션에 저온 유지 장치를 조정합니다. 1 ~ 4 절은 조직의 크기에 따라 각각의 슬라이드에 장소가 될 수 있습니다. </li><li> 즉시 2 분 동안 100 % 냉 에탄올로 슬라이드 급락. </li><li> 에탄올 펜 프레임 슬라이드를 제거하고 LCM에 대한 준비가 될 때까지 -80 ° C 냉장고에 데시 케이 상자에 슬라이드 상자에 슬라이드를 저장합니다. 사흘 최적 RNA 회수의 최대 축적 시간이다. </li><li> 충전 된 유리 슬라이드에 대해서만 2 단계를 진행합니다이자형. PEN 프레임 슬라이드의 3 단계로 진행합니다. </li></ol> 2. 헤 마톡 실린 및 에오신-Y (H &amp; E) 조직 학적 마크 업에 대한 얼룩 참고 :이 충전 된 유리 슬라이드에 조직과하지 LCM의 PEN 프레임 슬라이드의 경우. <ol><li> 다음과 같이 등급 에탄올 통해 슬라이드 침지 청구 유리 슬라이드 섹션 수화물 : 3 분, 두 동안 70 % 에탄올로 한 번, 3 분간, 3 분간 슬라이드를 95 % 에탄올에 두 번 100 % 에탄올에 두 번 찍어 3 분 동안 증류수 H 2 O의 시간. <ol><li> 99 ml의 70 % 에탄올 + 1 ml의 1 % HCl 및 0.1 % 중탄산 나트륨 용액 : 100 ㎖의 0.1 g 중탄산 나트륨 증류 H 2 O 산 알코올 용액을 조제 </li></ol></li><li> 5 분 동안 헤 마톡 실린 길 II (0.4 %)에서 슬라이드를 찍어. </li><li> 3 분 동안 지속적으로 실행 탭 H 2 O에 여분의 얼룩을 씻어 내십시오. </li><li> 슬라이드를 산 알코올의 10 배를 찍어 </li><li> 3 분 동안 탭 H 2 O를 실행에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 슬라이드를 찍어0.1 % 탄산 수​​소 나트륨 용액에 30 ~ 60 초 파란색 보라색 색상을 설정하려면하십시오. </li><li> 3 분 동안 탭 H 2 O를 실행에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 10 딥 95 % 에탄올에 슬라이드를 씻어. </li><li> 15 초 총 에오신-Y 2 ~ 3 시간에 슬라이드를 찍어. </li><li> 다음과 같이 등급 에탄올을 통해 슬라이드를 탈수 : 크실렌에 슬라이드 95 % 에탄올에 두 번, 100 % 에탄올에 두 번, 두 번 찍어 (조직이 철저한 탈수를 나타내는 명확한 표시해야합니다). </li><li> 비 수성 영구적으로 하드 장착 매체 커버 슬립과 슬라이드를 탑재합니다. </li><li> 30 분 동안 슬라이드 건조하자. </li><li> 어떤 전체 슬라이드 스캐너 스캔 슬라이드와 8 &quot;X 11&quot;용지에 대형, 고해상도 이미지를 인쇄 할 수 있습니다. </li><li> 관심의 개요 영역은 마커 (일반적으로 보드 인증 병리학 자에 의해 수행). 이 태그는 LCM 절차에 대한 가이드입니다. </li></ol> PEN 프레임 슬라이드 3. 톨루이딘 블루 염색 참고 : 목을LCM과 같은 날을 수행한다. 모든 솔루션을 depcH 2 O 물을 사용합니다. 의 RNase가없는 지역의 모든 단계를 완료합니다. 모든 coplins이 된 RNase-오염 제거 용액으로 세척해야합니다. <ol><li> LCM의 날은 2 분 후 2 분 동안 90 %의 EtOH에 부드럽게 찍기 슬라이드에 의해 75 %의 EtOH를 -80 ° C의 냉동고 및 수화물에서 펜 프레임 슬라이드를 제거합니다. <ol><li> 다음 실온에서 0.2 μm의 필터와 저장소를 통해 살균 필터 분자 생물학 수준의 물에 용해하여 0.5 % 톨루이딘 블루를 준비합니다. 이 용액은 최대 6 개월 동안 재사용 될 수있다. 참고 : 그것은 매우 전에 여과 몇 시간이 걸릴 수 있습니다로 솔루션을 준비하는 것이 좋습니다. </li></ol></li><li> 부드럽게 5-30 초 동안 0.5 % 톨루이딘 블루로 슬라이드를 침지하여 전립선 조직을 염색. 세탁에 의한 조직은 3 분 30 초 동안 75 % EtOH로 다음 15 초 동안 depcH 2 O 2 번 슬라이드 Destain. 주 : 얼룩과 destain 시간은 양호한 염색을 위해 조정될 수있다. 전립선은 얼룩 위에 경향이있다. </li><l난&gt; 얼음에 RNAase없는 건조한 용기에 펜 프레임 슬라이드를 전송합니다. </li></ol> 4. 레이저 캡처 마이크로 해부 (LCM) <ol><li> LCM, 15 분 동안 42 ° C에서 따뜻한 슬라이드에 건조 슬라이드 직전. 처리하고 준비가 될 때까지 얼음에 나머지를 저장한다 드라이 만 슬라이드. </li><li> LCM과 컴퓨터의 순서로, 현미경 전력, 레이저 키, 레이저 스위치 다음 컴퓨터를 켭니다. 레이저 이외에 Microdissection 소프트웨어를 실행합니다. </li><li> 슬라이드 및 수집 튜브를로드하기 위해 현미경을 제어하는​​ 소프트웨어를 사용합니다. 다음 &quot;계속&quot;을 클릭, &quot;언로드 샘플 홀더&quot;를 클릭하면 아래로 향하게 조직과 현미경 슬라이드 홀더에 섹션 슬라이드를로드하고 현미경의 해당 슬롯에 슬라이드 홀더를 삽입합니다. <ol><li> &quot;언로드 수집 관&quot;, 레이블을 클릭하고 튜브 홀더에 0.5 ml의 튜브를로드 및 기기의 해당 슬롯에 삽입합니다. 일단캡 컬렉션 캡에 용해 버퍼의 35 μl를 추가하고 거품을 피하려고, 고정된다. 그런 다음 &quot;확인&quot;을 클릭합니다. 참고 : 25 ㎕의 용해 완충액을 10 μL로 depcH2O : 증발이 문제가되어있는 경우에는 다음과 같이, 희석 완충액. </li></ol></li><li> 소프트웨어에서 슬라이드가 슬라이드 홀더에 배치 된 위치를 선택합니다. LCM 표본을 수집하는 수집 캡을 선택합니다. </li><li> 시각화 및 10X에서 컴퓨터를 통해 슬라이드를 초점을 맞 춥니 다. 다음 &quot;보정&quot;, &quot;레이저&quot;를 선택하여 레이저를 보정 소프트웨어를 사용합니다. 레이저 빔이 완전하고 효율적으로 선택된 영역을 절감 할 수 있도록, 레이저의 파워, 개구 수 및 속도 선택 &quot;레이저&quot;다음 &quot;제어&quot;를 조정한다. 완전히 조직을 통해 레이저 절단 될 때까지 조정을 반복합니다. </li><li> 가이드로 8 &quot;X 11&quot;병리학 마크 업 사용 epithe의 원하는 영역을 에워하기 위해 &quot;모양을 그립니다&quot;도구를 사용하여보기 lium과는 기질를 수집하지 마십시오. 여러 영역이 하나의보기에서 선택 될 수 있지만 &quot;모양을 잘라&quot;도구를 클릭하여 제 1 절단하지 않고 다른보기로 이동하지 않습니다 있습니다. <ol><li> 영역이 완전히 레이저로 절단되지 않는 경우 수동으로 그 위에 이동합니다 &quot;이동 잘라&quot;도구를 사용합니다. 새로운 뷰에 목적을 이동 계속 슬라이드가 완전히 해부 또는 조직의 원하는 양이 수집 될 때까지 레이저 절단을 반복 (일반적으로 100 양성 땀샘은 RNA의 150-500 NG를 얻을). (그림 1A의 예 참조). </li></ol></li><li> 조심스럽게 뚜껑에 용해 버퍼 및 조직 염두되고, 수집 홀더에서 튜브를 제거하고 뚜껑을 닫습니다. 간단히 튜브의 바닥에서 액체 및 조직을 수집하기 위해 30 초 동안 원심 분리. RNA 분리에 대한 준비가 될 때까지 -80 ° C에서 30 분 및 저장을 위해 42 ° C에서 샘플을 품어. </li></ol> 필 5. 전체 RNA를 분리터 기반 키트 및 품질 분석 <ol><li> 얼음에 튜브를 해동 100 μL로 용액의 부피를 가지고. </li><li> 필터의 중심에 30 μL ofLysis 용액을 도포하여 RNA 분리 키트의 마이크로 필터를 미리 적시고 그 다음에 두 단계 (적어도 5 분) whileperforming 침지 할 수있다. </li><li> 해물에 (키트에 제공) LCM 첨가제 솔루션의 3 μl를 추가하고 5 초 동안 소용돌이로 교반하여 혼합한다. 상기 튜브의 하단에있는 유체를 수집하기 위해 30 초 동안 원심 분리한다. </li><li> 액체를 제거하기 위해 최고 속도에서 30 초 ~에 대한 사전 젖은 필터를 원심 분리기. </li><li> 위아래로 부드럽게, 해물 혼합물에 소용돌이 또는 피펫을 100 % 에탄올 (이 경우 129 μL)에 1.25 볼륨을 추가합니다. **이 방법은 크고 작은 RNA 종을 모두 복구합니다. </li><li> 1 분 필터로 RNA를 결합하는 10,000 XG에서 사전 습윤 마이크로 필터 상에 샘플과 원심 분리기를로드합니다. 그런 다음 세척 용액 1, R &quot;의 180 μL와 마이크로 필터를 세척(21); 1 분 10,000 XG에 원심 분리기. 참고 : 모든 회 원심이 시점은 13,000 XG, 또는 최대 속도로 수행해야합니다에서. </li><li> 키트 프로토콜의 지시에 따라 세척은 각각 &quot;세척 솔루션 2, 3&quot;180 μL, 두 번 필터링 할 수 있습니다. 원심 분리 잔류 유체를 제거하고 필터를 건조 30 초 후, 플로우 스루를 폐기하고, 1 분 동안 스핀 필터. </li><li> 새 컬렉션 튜브 필터를 전송합니다. </li><li> (키트와 함께 제공) -95 ℃로 따뜻한 용출 솔루션입니다. </li><li> 필터의 센터로 예열 용출 용액 10 μL를 적용, 뚜껑을 닫고 실온에서 5 분 동안 저장한다. 이어서 RNA를 용출 한 분 동안 원심 분리 한 RNA ~ 20 μl를 수득이 단계를 한 번 반복한다. </li><li> 37 ° C에서 15 분간의 DNase I 처리를 수행한다. </li><li> 260 nm에서 흡광도와 분광 광도계에 의한 RNA를 정량화. 260 nm 내지 280 nm의 파장에서의 광학 밀도의 비의 순도를 평가하기 위해 이용된다RNA는 15 (표 1 참조). </li></ol> 6. 유전자 발현 분석 참고 : (의 mRNA와 lncRNAs 등) 긴 RNA 종의 유전자 발현하는 것은 단계 6.1과 짧은 RNA 종 (마이크로 RNA 등)에 표시됩니다 단계 6.2에 표시됩니다. 다른 키트는 RT-qPCR에 사용할 수 있습니다 필요한 RNA의 양이 (10 NG로 적게) 키트에 따라 다릅니다. RNA 서열 분석은 6.3에 기재되어있다. <ol><li> 역방향 스크립트 작성 (RT) 5 RT 마스터 믹스 μL (RT 완충액의 dNTP의 랜덤 프라이머, RT 효소, RNA 분해 효소 억제제) 20 ng의 5 μL / RNA 샘플 μL를 혼합하는 cDNA에 RNA. 37 ℃에서 120 분 후, 25 ° C에서 25 분 동안 인큐베이션하고, 반응을 85 ° C에서 5 분. </li><li> 의 RNase 무료 물 RT 반응 1:10 희석과 관심의 유전자에 대한 프라이머 또는 프라이머 / 프로브 세트 10 μL qPCR에 반응 당 2.5 μL를 사용합니다. 주 : 부분적으로 저하 RNA의 분석을 용이하게하기 위해이 fo를 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다R 짧은 증폭 (이하 100 BP) 16. (표 2B) <ol><li> 마이크로 RNA 발현 분석을 위해 RT 마스터 믹스의 5 μL로 2-10 NG의 5 μL / RNA 샘플 μL를 혼합하여 RT 반응을 실행. 주 : 각 시판의 PCR 기반 마이크로 RNA 탐지 기술은 특허 특정 RT 프라이머의 사용을 필요로한다. </li></ol></li><li> 대안 적으로 또는 RT-PCR에 더하여, RNA를 상이한 종을 정량화하기 위해 차세대 시퀀싱 (RNA-SEQ 또는 작은 RNA-SEQ)를 사용한다. 일반적으로,이 절차 (표 3)에 대해 500 ng의 RNA를 사용하여 제조 및 검출기구에 의해 지시 된 바와 같이 방법을 수행. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

표본에서 인간 유전자 발현 프로파일 링이 가능 품질 또는 조직의 수량뿐만 아니라, 주어진 조직 표본에 존재하는 다양한 조직 학적 엔티티뿐만 아니라, 도전 일 수있다. 이것은 양성 조직은 주로 간질 조직 및 암 영역이다 기질 결여 된 전립선에 특히 도전적이다. LCM은 두 개의 서로 다른 유형의 세포 (도 1A)의 더 정확한 서명 전립선 상피와 기질 RNA의 물리적 분리를 용이하게한다. mac...

전립선은 주로 평활근 1로 구성 fibromuscular 기질에 둘러싸여 샘 꽈리에 배치 분비 상피 세포로 구성된 이종 조직이다. 기저 세포 분비 세포, 신경 내분비 세포, 중계 증폭 세포 및 줄기 세포 2 : 상피 구획 다섯 다르지만 조직 유형의 세포로 구성된다. 내강 상피 세포로부터 발생 전립선 암 (PCA)에있어서, 선암 성장 기질 구획 (3)의 점진적인 하락 분명시킨다. 이러한 이유로, 조직 표본은 PCA의 정도에 기초하여 기질과 상피 세포 유형의 비율 뚜렷한 차이가있을 것이다. 이러한 차이는 원하는 세포 유형의 미세 절제에 관계없이 전체 조직에서 얻은 유전자 발현 데이터의 바이어스 된 가정을 초래할 수있다. 따라서, 이러한 바이어스를 제거하는 것이 종래 RNA 추출 및 세포 유형을 분리하는 것이 필수적이다유전자 발현 분석. Macrodissection 미세 절제 또는 물리적 주변 기질 4 -6에서 잘 특성화 상피 영역을 분리하기 위해 사용될 수있다. Macrodissection는 일반적으로 해부 현미경 면도날으로 수행하고 큰 PCA는 기질에서 결절 분리 잘 작동하지만, 기질 주변에서 양성 상피를 제거 할 수 없습니다 (그림 1에서 양성 전립선 조직 검사의 예를 참조). 레이저 (LCM)와 미세 절제는 macrodissection보다 훨씬 더 많은 노동 집약적이지만, 매우 정확하게 양성 상피 (4)를 해부 할 수 있습니다. 우리의 실험실에서 최근 출판물은 RNA가 성공적으로 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) 조직 검사 또는 냉동 조직 4,7-9 중 하나에서 LCM에 의해 추출 될 수 있음을 보여 주었다. LCM-RNA 추출의 주요 과제는 R 1)을 정확하게 조직의 원하는 부분을 해부하고, 2) 보존하려면LCM 및 분리 공정 4,10 동안 NA의 무결성. 순수한 세포 집단에서 분리 된 RNA는 정량적 역전사 PCR (RT-qPCR에) 7,8, 마이크로 어레이 (11), 및 깊은 -sequencing 12-14 포함한 여러 방법에 의해 유전자 발현 분석을 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜의 목적은 하류 유전자의 발현 분석을 위해 냉동 된 조직으로부터의 LCM 전립선 상피 세포에서 총 RNA를 분리하는 것이다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RNase-AWAY&#160;</td>
			<td>MBP</td>
			<td>7005-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN-membrane 4,0 mm slides&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11600289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides, Superfrost Plus</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon labs.</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC (diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplins (Staining jar)</td>
			<td>IHCWORLD</td>
			<td>M900-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplins (Staining rack)</td>
			<td>IHCWORLD</td>
			<td>M905-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperio ScanScope</td>
			<td>Aperio(Leica)</td>
			<td>ScanScope&#174; CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>89640-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection System</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL Thin-walled Tubes for LCM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAqueous&#174;-Micro Total RNA Isolation Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1931</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>203301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA RT kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366597</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin stain&#160;</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3536-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y</td>
			<td>Richard Allan Scientific&#160;</td>
			<td>7111</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-capture microdissection of human prostatic epithelium for rna analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

이전 연구에서 우리는 동일한 환자 (4)로부터 냉동 FFPE 전립선 조직에서의 mRNA 및 마이크로 RNA의 RT-qPCR에 의해 발현 프로파일을 비교하는 상피 및 간질 조직을 수집하는 LCM의 사용을 설명했다. LCM은 RNA의 다량 차세대 염기 서열 분석을 위해 수집하는 경우 특히, 시간 소모적이다. 따라서, 작업 공간을 유지하는 것이 중요하며 툴 무연의 RNase. 그것은 (다음 단락에서 자세히 설명) 수집 RNA의 ?...

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Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

RNA 분석을위한 인간의 전립선 상피 세포의 레이저 캡처 이외에 Microdissection

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

laser-capture-microdissection-human-prostatic-epithelium-for-rna

Research

JoVE Journal

Medicine

13.3K 조회수.  University of Illinois at Chicago. The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

비디오: Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions between vitreous substructures and the retina underlie several vitreoretinal diseases, including retinal tear and detachment, macular pucker, macular hole, age-related macular degeneration, vitreomacular traction, proliferative vitreoretinopathy, proliferative diabetic retinopathy, and inherited vitreoretinopathies. 1,2 The molecular composition of the vitreous substructures is not known. Since the vitreous body is transparent with limited surgical access, it has been difficult to study its substructures at the molecular level. We developed a method to separate and preserve these tissues for proteomic and biochemical analysis. The dissection technique in this experimental video shows how to isolate vitreous base, anterior hyaloid, vitreous core, and vitreous cortex from postmortem human eyes. One-dimensional SDS-PAGE analyses of each vitreous component showed that our dissection technique resulted in four unique protein profiles corresponding to each substructure of the human vitreous body. Identification of differentially compartmentalized proteins will reveal candidate molecules underlying various vitreoretinal diseases.

This video shows an effective technique for differentiating and dissecting the various semi-transparent structures of the human vitreous body in post mortem eyes.

Proteomic 분석을위한 인적 유리 바디 요소의 해부

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions ...

연구

의학

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

수술 표본에서 인간 췌장 섬의 레이저 Microdissection을위한 개선 된 프로토콜

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Progress in prostate cancer research is severely limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems, which limit our ability to understand genetic and molecular events underlying prostate disease initiation. Toward developing better model systems for studying human prostate carcinogenesis, we and others have taken advantage of the unique pro-prostatic inductive potential of embryonic rodent prostate stroma, termed urogenital sinus mesenchyme (UGSM). When recombined with certain pluripotent cell populations such as embryonic stem cells, UGSM induces the formation of normal human prostate epithelia in a testosterone-dependent manner. Such a human model system can be used to investigate and experimentally test the ability of candidate prostate cancer susceptibility genes at an accelerated pace compared to typical rodent transgenic studies. Since Human embryonic stem cells (hESCs) can be genetically modified in culture using inducible gene expression or siRNA knock-down vectors prior to tissue recombination, such a model facilitates testing the functional consequences of genes, or combinations of genes, which are thought to promote or prevent carcinogenesis.
The technique of isolating pure populations of UGSM cells, however, is challenging and learning often requires someone with previous expertise to personally teach. Moreover, inoculation of cell mixtures under the renal capsule of an immunocompromised host can be technically challenging. Here we outline and illustrate proper isolation of UGSM from rodent embryos and renal capsule implantation of tissue mixtures to form human prostate epithelium. Such an approach, at its current stage, requires in vivo xenografting of embryonic stem cells; future applications could potentially include in vitro gland formation or the use of induced pluripotent stem cell populations (iPSCs).

To unravel the earliest molecular mechanisms underlying prostate cancer initiation, novel and innovative human model systems and approaches are desperately needed. The potential of pre-prostatic urogenital sinus mesenchyme (UGSM) to induce pluripotent stem cell populations to form human prostate epithelium is a powerful experimental tool in prostate research.

설치류 비뇨 부비동 간엽 및 인간 줄기 세포의 조직 재조합을 사용하여 인간의 전립선 상피의 형성

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

New therapies for two common prostate diseases, prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend critically on experiments evaluating their hormonal regulation. Sex steroid hormones (notably androgens and estrogens) are important in PrCa and BPH; we probe their respective roles in inducing prostate growth and carcinogenesis in mice with experiments using compressed hormone pellets. Hormone and/or drug pellets are easily manufactured with a pellet press, and surgically implanted into the subcutaneous tissue of the male mouse host. We also describe a protocol for the evaluation of hormonal carcinogenesis by combining subcutaneous hormone pellet implantation with xenografting of prostate cell recombinants under the renal capsule of immunocompromised mice. Moreover, subcutaneous hormone pellet implantation, in combination with renal capsule xenografting of BPH tissue, is useful to better understand hormonal regulation of benign prostate growth, and to test new therapies targeting sex steroid hormone pathways.

We describe the manufacture of compressed hormone pellets, as well as subcutaneous surgical implantation into mice. This strategy can be combined with the growth of cell and tissue xenografts under the renal capsule of athymic nude mice to evaluate hormonal carcinogenesis and regulation of benign prostate growth.

전립선 발암 및 양성 전립선 비대증의 평가를위한 신장 캡슐 Xenografting 및 피하 펠렛 주입

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

물고기는 눈을 통해 당뇨병을 공부: 기정, 시각화, 및 성인 tg(fli:EGFP) Zebrafish 망막 맥 관 구조 분석

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Surgical Treatment for Benign Prostatic Hyperplasia: Holmium Laser Enucleation of the Prostate (HoLEP).

Benign prostatic hyperplasia (BPH) commonly occurs among elderly males. The condition causes symptoms in the lower urinary tract, thereby reducing the quality of life. BPH includes 2 major treatments: medication and surgery. Surgical treatment is often the most effective and final intervention. Holmium laser enucleation of the prostate (HoLEP), one of the most efficient surgical procedures for BPH, is conducted transurethrally. During surgery, the most important and most difficult part is to locate the surgical capsule of the prostate, which is consistent to the idea of anatomic surgery. Different skills may be needed in treating different parts of the prostate. HoLEP tends to be efficient and safe with good hemostatic properties, and able to treat bladder calculus, which may be the complications of BPH. The technique is particularly suitable for prostate of varying volumes and sizes. Indeed, HoLEP also presents certain disadvantages, such as a long learning curve and costly equipment. Regardless, this method may be the "new standard" and the excellent method for the surgical treatment of BPH.

Surgical Treatment for Benign Prostatic Hyperplasia: Holmium Laser Enucleation of the Prostate HoLEP.

Here we present a safe and efficient protocol, holmium laser enucleation of the prostate, to treat benign prostatic hyperplasia.

양성 전립선 비 대 증에 대 한 수술 치료: Holmium 레이저 Enucleation (HoLEP) 전립선의.

Benign prostatic hyperplasia (BPH) commonly occurs among elderly males. The condition causes symptoms in the lower urinary tract, thereby reducing the ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel therapeutics are urgently required. The ability of dosed TB drugs to reach and sterilize bacteria within poorly-vascularized necrotic regions (caseum) of pulmonary granulomas is crucial for successful therapeutic intervention. Effective therapeutic regimens must therefore contain drugs with favorable caseum penetration properties. Current LC/MS methods for quantifying drug levels in biological tissues have limited spatial resolution capabilities, making it difficult to accurately determine absolute drug concentrations within small tissue compartments such as those found within necrotic granulomas. Here we present a protocol combining laser capture microdissection (LCM) of pathologically-distinct tissue regions with LC/MS quantification. This technique provides absolute quantification of drugs within granuloma caseum, surrounding cellular lesion and uninvolved lung tissue and, therefore, accurately determines whether bactericidal concentrations are being achieved. In addition to tuberculosis research, the technique has many potential applications for spatially-resolved quantification of drugs in diseased tissues.

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Here, we describe a protocol using laser capture microdissection coupled with LC/MS analysis to spatially-quantify drug distributions within pulmonary tuberculosis granulomas. The approach has broad applicability to quantifying drug concentrations within tissues at high spatial detail.

레이저에 의해 폐 결핵 병 변에서 약의 공간 정량화 캡처 서 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a promising therapeutic target in many disorders, such as autoimmune diseases, atherosclerosis, and cancer. RNAi-mediated gene silencing is a valuable approach of choice to probe and manipulate macrophage function; however, the transfection of macrophages with siRNA is often considered to be technically challenging, and, at present, few methodologies dedicated to the siRNA transfer to macrophages are available. Here, we present a protocol of using polyethyleneimine-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (PEI-SPIONs) as a vehicle for the targeted delivery of siRNA to macrophages. PEI-SPIONs are capable of binding and completely condensing siRNA when the Fe:siRNA weight ratio reaches 4 and above. In vitro, these nanoparticles can efficiently deliver siRNA into primary macrophages, as well as into the macrophage-like RAW 264.7 cell line, without compromising cell viability at the optimal dose for transfection, and, ultimately, they induce siRNA-mediated target gene silencing. Apart from being used for in vitro siRNA transfection, PEI-SPIONs are also a promising tool for delivering siRNA to macrophages in vivo. In view of its combined features of magnetic property and gene-silencing ability, systemically administered PEI-SPION/siRNA particles are expected not only to modulate macrophage function but also to enable macrophages to be imaged and tracked. In essence, PEI-SPIONs represent a simple, safe, and effective nonviral platform for siRNA delivery to macrophages both in vitro and in vivo.

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

We describe a method of using polyethyleneimine (PEI)-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles for transfecting macrophages with siRNA. These nanoparticles can efficiently deliver siRNA to macrophages in vitro and in vivo and silence target gene expression.

Polyethyleneimine 코팅 된 산화 철 나노 입자 작은 간섭 RNA의 세포에 배달 하는 수단으로 생체 외에서 그리고 Vivo에서

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release different bioactive molecules that control metabolic, hormonal, and immune processes; currently, it is unclear how these processes are regulated within the adipose tissue. Therefore, the development of methods evaluating the contribution of each cell population to the pathophysiology of adipose tissue is crucial. This protocol describes the isolation steps and provides the necessary troubleshooting guidelines for efficient isolation of viable mature adipocytes and SVF from human VAT biopsies in a single process, using a collagenase enzymatic digestion technique. Moreover, the protocol is also optimized to identify macrophage subsets and perform mature adipocyte RNA isolation for gene expression studies, which allows performing studies dissecting the interaction between these cell populations. Briefly, VAT biopsies are washed, minced mechanically, and digested to generate a single-cell suspension. After centrifugation, mature adipocytes are isolated by flotation from the SVF pellet. The RNA extraction protocol ensures a high yield of total RNA (including miRNAs) from adipocytes for downstream expression assays. Simultaneously, SVF cells are used to characterize macrophage subsets (pro- and anti-inflammatory phenotype) through flow cytometry analysis.

This protocol provides an efficient collagenase digestion method for isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction-SVF cells from human visceral fat in a single process, including methodology to obtain high-quality RNA from adipocytes and phenotypification of SVF-macrophages through staining of multiple membrane-bound markers for analysis by flow cytometry.

RNA 분석 및 대식세포 표현형에 적합한 인간 내장 지방 조직에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획 분리

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

퇴행성 망막 질병을 위한 비인간 영장류 모형에 있는 망막 안료 상피 이식

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...