We thank David A. Ferrick and David G. Nicholls for contributing to project conception and presentation, Renata L.S. Goncalves and Akos A. Gerencser for data not shown here and for helpful discussions, Barbara Liepe for XF24 consumables, and Andy Neilson for input in developing Eq. (5).

1. Mesurer Buffering Puissance en un flux Instrument extracellulaire: deux variantes REMARQUE: les calculs et les méthodes décrites ici ont été développées à l&#39;aide d&#39;un analyseur de Flux extracellulaire. Pour les autres instruments, le volume de mesure doit être mise à l&#39;échelle appropriée. <ol><li> Préparer 0,1 M HCl norme dans l&#39;eau en utilisant du HCl concentré (voir matériel et équipement) selon les instructions du fabricant. Remarque: Un exemple de calcul pour préparer des injections HCl pour une utilisation dans les quatre ports d&#39;injection est indiqué dans le Tableau 1: </li></ol><img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/53464/53464table1.jpg" /> Tableau 1. injections consécutives HCl dans un dosage flux extracellulaire ainsi. <ol start="2"><li> Préparer des dilutions de la norme HCl dans le milieu à doser comme dans le tableau 1 pour le nombre de répétitions techniques étant carrIED dans une plaque, plus un pour permettre à l&#39;erreur de pipetage; par exemple, pour les quatre répétitions techniques du port A d&#39;injection, préparer un stock de (1,1 pi x 5) HCl 0,1 M dans (48,9 pi x 5) milieu de dosage. </li><li> Distribuer 50 ul dans chaque port A de la cartouche de la sonde de mesure. Répétez cette procédure pour les ports restants B, C, et D. </li><li> Exécutez un test de flux extracellulaire 10 avec un cycle d&#39;étalonnage standard, suivie de deux cycles de [2 min mélange, 1 min d&#39;attente, et 5 min de la mesure] pour chacun des quatre ajouts portuaires (voir la figure 2). <ol><li> Programmer l&#39;expérience ci-dessus dans le logiciel de l&#39;instrument selon les instructions du logiciel. Charger la cartouche préparé dans la machine et effectuer le calibrage selon les instructions du logiciel. </li><li> Lorsque vous êtes invité par le programme, retirez la plaque contenant étalon-et insérer la plaque contenant du milieu d&#39;essai dans chaque puits dans l&#39;instrument; poursuivre le programme. </li></ol></li><li> U<html> chanter la moyenne de 8-10 points de données obtenues à l&#39;état d&#39;équilibre (en général les 8-10 derniers points) avant et après chaque addition de port, calculer la (cumulatif) différence de pH (ApH) causés par chaque injection d&#39;acide standard. </li><li> Tracer ApH contre nmol H + contenu dans le volume 7 ul piégé par la sonde de mesure. La pente linéaire est le pouvoir tampon (BP) en MPH / pmol H +. </li><li> Alternativement aux étapes 1,2-1,3, effectuer les mesures suivantes de ApH un essai dans lequel des ports A, B, et C sont utilisés pour mener une expérience, suivie par une injection HCl à Port D. Comme dans le tableau 2, quatre répétitions techniques sont utilisé pour générer chaque point d&#39;une courbe standard de 5 points dans les 20 puits expérimentaux (à l&#39;exclusion des puits de correction de température de quatre de fond) de la plaque de flux extracellulaire de dosage. </li></ol>53464table2.jpg &quot;/&gt; Tableau 2. injection HCl simple dans un test de flux extracellulaire bien. 2. Mesurer Buffering alimentation Utilisation d&#39;un pH-mètre externe NOTE: Pour mesurer le pouvoir tampon d&#39;un support en utilisant une sonde de pH externe, étalonner la sonde à 37 ° C et maintenir cette température pendant tous les réactifs pendant l&#39;expérience. <ol><li> Préparer 0,1 M HCl norme dans l&#39;eau en utilisant du HCl concentré selon les instructions du fabricant. </li><li> Chaud sonde de pH, les normes de pH, le milieu de dosage dont le pouvoir tampon est à mesurer, et du HCl 0,1 M à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Calibrer sonde de pH à 37 ° C selon les instructions du fabricant. Maintenir tous les réactifs à 37 ° C tout au long de l&#39;essai en utilisant une plaque chauffante ou un bain d&#39;eau. </li><li> Aliquote de 10 ml du milieu d&#39;essai dans un petit bêcher ou un tube conique. Contrôler le pH en continu en utilisant une sonde de pH immergé. </li><li> Ajouter HCl 0,1 M comme à ladire en 10-20 aliquotes pi de milieu. <ol><li> Assurer le mélange à l&#39;aide d&#39;une barre d&#39;agitation ou par tourbillon manuellement le conteneur après chaque addition d&#39;acide. </li><li> Attendre quelques secondes pour la mesure du pH pour stabiliser, puis enregistrer le pH après chaque addition. </li><li> Comme le montre le tableau 3, faire un nombre suffisant d&#39;ajouts pour assurer calcul de pente précis et pour couvrir la gamme de pH attendu pendant l&#39;expérience. </li></ol></li></ol><img alt="Tableau 3" src="/files/ftp_upload/53464/53464table3highres.jpg" width="650" /> Tableau 3. Mesure de la puissance de mise en mémoire tampon en utilisant un pH-mètre. Les données représentent une expérience typique avec six additions de 20 ul de HCl 0,1 M. <ol start="6"><li> Plot ApH contre nmol ajouté par H + 7 ul, ce qui donne une pente linéaire qui représente le pouvoir tampon (Figure 1). </li></ol> Figure 1. Déterminer pouvoir tampon. HCl courbe d&#39;étalonnage mesurée comme dans le tableau 1, le tableau 2 ou (ici) comme dans le tableau 3. La pente de la courbe en forme linéaire donne le pouvoir tampon (pH / nmol H + dans 7 ul). Chaque point représente moyenne ± SEM de n = 9 répétitions techniques. <ol start="7"><li> Une fois que le pouvoir tampon est connu par la méthode 1 ou 2 ci-dessus, convertir le signal de ECAR (mph / min) à PPR (pmol H + / min / protéine ug) en divisant ECAR par la puissance mise en mémoire tampon (BP) (MPH / pmol H +) mise à l&#39;échelle et à la teneur en protéine de chaque puits: PPR tot (pmol H + / min / pg de protéine) = ECAR (mph / min) / BP (mph / pmol H + à 7 pi) / protéines par puits (pg) L&#39;équation 6 </li><li> Sinon, utilisez les mêmes expériences dans la méthodes 1 ou 2 pour calculer la capacité tampon (BC) valeur utilisée par le logiciel de l&#39;appareil pour calculer automatiquement PPR lors de la collecte de données. REMARQUE: L&#39;utilisateur de l&#39;instrument manuel 12 (page 107) fournit des informations détaillées sur le calcul et l&#39;utilisation de la capacité tampon, où BC est décrit comme BC (mol / L) = moles H + / (ApH x volume tampon (L)) L&#39;équation 7 NOTE: Le pouvoir tampon tel que défini dans l&#39;équation 7 peut être calculée dans les essais de l&#39;instrument ou de la sonde de pH externe décrites ci-dessus. Conversion entre pouvoir tampon capacité tampon et se fait facilement (voir tableau joint): BC = 1 x 10 -9 / BP ((mph / pmol H + à 7 pi) / 7 pi) de l&#39;équation 8 NOTE: Si connue avant d&#39;effectuer le test, la capacité tampon peut être entré directement dans le logiciel de l&#39;appareil lors de l&#39;installation expérimentale. </li><li>Appliquer cette procédure et les calculs utilisés ci-dessus pour la plupart des systèmes tampons classiques, comme décrit dans la publication précédente 6. NOTE: Le tableau 4 donne la liste de pouvoir tampon capacité tampon et de plusieurs médias conventionnels. </li></ol><img alt="Tableau 4" src="/files/ftp_upload/53464/53464table4.jpg" /> Tableau 4. pouvoir tampon et la capacité de mise en mémoire tampon des médias sélectionnés. 3. Réalisation d&#39;une extracellulaire Flux dosage utilisant cellules C2C12 de myoblastes NOTE: Dans l&#39;étape 3.4.3, il n&#39;y avait pas de différences observées dans CO 2 -derived production d&#39;acide dépend de la présence de l&#39;anhydrase carbonique dans la culture C2C12, suggérant que sa présence ne soit pas nécessaire pour la conversion complète de CO 2 à HCO 3 - H + +. Cependant, tester empiriquement ce dans différents systèmes expérimentaux est recommandé avant omanhydrase carbonique itting. <ol><li> Culture souris C2C12 de myoblastes 13 à 37 ° C sous 95% d&#39;air / 5% de CO2 dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec du glucose 11,1 mM, 2 mM de glutamine, 10% en volume de sérum / v bovin fœtal (FBS), 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine. </li><li> 24 h avant l&#39;essai, les cellules plaque / graines dans 100 ul du même milieu de culture à 20.000 cellules / puits dans une plaque de dosage à 24 puits en polystyrène flux extracellulaire (voir Matériels et Méthodes) sans revêtement supplémentaire. </li><li> Diluer oligomycine, FCCP, et la roténone, plus myxothiazol et HCl (en option) à 10x concentration finale dans Krebs Ringer phosphate HEPES (KRPH) milieu de dosage (2 mM HEPES, NaCl 136, 2 mM NaH 2 PO 4 mM, KCl 3,7, 1 mM de MgCl2, 1,5 mM de CaCl2, 0,1% p / v d&#39;albumine de sérum bovin gras-acide, pH 7,4 à 37 ° C). </li><li> La préparation des cellules <ol><li> 30 min avant le test, laver les cellules adhérentes trois fois en aspirant à GEretirer ntly le moyen du puits, puis en ajoutant lentement 500 KRPH ul. </li><li> Incuber les cellules après l&#39;étape de lavage troisième à 37 ° C sous air (pas moins de 5% de CO 2, ce qui modifiera le pH de ce milieu exempt de bicarbonate). </li><li> Au début de l&#39;essai, remplacer KRPH dans les puits avec 500 pi KRPH frais contenant anhydrase carbonique 500 U / ml et soit du glucose (10 mM) ou seulement moyen, sans substrat supplémentaire. </li></ol></li><li> Chargement de la cartouche du capteur <ol><li> Pipet 50 aliquotes de chaque composé 10x préparé à l&#39;étape 3.3 dans les ports d&#39;une cartouche extracellulaire flux de capteur comme suit (concentrations finales dans les tests ainsi donnés) de la cartouche: Port A: 2 pg / ml oligomycine, Port B: 0,5 uM FCCP, Port C : roténone 1 uM, 1 uM myxothiazol, Port D: HCl (si l&#39;exécution d&#39;une calibration in-dosage de l&#39;acide comme décrit ci- dessus et dans le tableau 2). NOTE: dans le but d&#39;une inhibition complète de la chaîne respiratoire décrit ici, 1 pm mesxothiazol peut être utilisé de manière interchangeable avec 1 uM antimycine A. </li></ol></li><li> Extracellulaire dosage flux: <ol><li> Effectuez un test de flux extracellulaire standard pour la détermination du contrôle respiratoire comme décrit dans 10. </li></ol></li></ol> NOTE: Pour chaque segment de l&#39;expérience, de déterminer la combinaison, attendez, et les temps de mesure souhaitée, ainsi que le nombre de cycles par segment. REMARQUE: Les données du tableau 5 ont été recueillies au cours de deux cycles de dosage de 2 min mix, 1 minutes d&#39;attente, et à 5 min mesure pour chaque segment, avec trois cycles d&#39;essai se produisant après l&#39;addition du port D de différentes quantités de HCl (pour l&#39;étalonnage de la mémoire tampon puissance comme dans le Tableau 2). <img alt="Tableau 5" src="/files/ftp_upload/53464/53464table5.jpg" /> Tableau 5. configuration de test flux extracellulaire. 4. DE MESUREFin ng-point de la concentration de lactate Remarque: Afin de valider le test indirect décrit ici dans un système différent, le point extrémité concentration de lactate à la fin d&#39;une expérience de flux extracellulaire peut être déterminée directement dans une plaque à 96 puits classique par mesure de la vitesse initiale (plus de 2 minutes) de réduction de NAD + NADH → catalysée par la lactate déshydrogénase, décrit en détail dans notre publication préalable 6. Pour les données présentées dans Les résultats représentatifs, la concentration de lactate de point final dans les puits d&#39;essai contenant du glucose était ~ 40 pm. <ol><li> Préparer moyen d&#39;hydrazine 2x: 1 M de Tris, 20 mM d&#39;EDTA, 400 mM d&#39;hydrazine à pH 9,8 à 22 ° C). Immédiatement avant le début de l&#39;essai, ajouter NAD + 4 mM de lactate déshydrogénase et (LDH) à 40 U / ml. Composition de milieu d&#39;essai final (1x): 500 mM de Tris, 10 mM d&#39;EDTA, 200 mM d&#39;hydrazine, 2 mM de NAD +, 20 U / ml de LDH. </li><li> Immédiatement après le dosage flux extracellulaire, retirer 100pi de milieu de dosage de chaque puits de la plaque de dosage flux extracellulaire et le transfert à un puits d&#39;une opaque (noir) plaque de 96 puits. </li><li> Pour chaque échantillon, ajouter 100 pi 2x moyen d&#39;hydrazine. </li><li> Charger immédiatement la plaque dans un lecteur de microplaques et de commencer à surveiller la fluorescence de NADH à 340 nm d&#39;excitation / émission à 460 nm. </li><li> Enregistrer la vitesse initiale d&#39;environ 2 min. </li><li> Exécuter une expérience similaire à construire une courbe d&#39;étalonnage en traçant la vitesse initiale de la concentration de lactate pour des concentrations de lactate ajoutés de 0 à 50 uM. </li><li> Calculer la concentration de lactate dans chaque puits expérimental utilisant la courbe standard. </li></ol> 5. Mesure Teneur en protéines <ol><li> Retirer le reste de milieu d&#39;essai à partir de chaque puits de la plaque de dosage. </li><li> Laver les puits trois fois avec 250 ul KRPH libre-BSA, en prenant soin de minimiser le délogement des cellules de la surface de fond de puits. </li><li> Ajouter 25 ul lyse RIPAmoyen (NaCl 150 mM, Tris 50 mM, EGTA 1 mM, EDTA 1 mM, 1% v / v de Triton X-100, 0,5% p / v de désoxycholate de sodium, 0,1% v / v de SDS, pH 7,4 à 22 ° C) à chaque puits de la plaque de dosage. </li><li> Incuber la plaque sur de la glace pendant 30 min. </li><li> Agiter la plaque sur un agitateur de plaque à 1200 rpm pendant 5 min. </li><li> Mesurer la concentration de protéines par des procédés classiques, par exemple par dosage BCA, en veillant à ce que la composition du tampon de lyse est compatible avec la méthode de mesure. La teneur en protéines dans l&#39;expérience sur la figure 2 était d&#39;environ 4 ug / puits. </li></ol>

<ol>
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Dr Shona Mookerjee déclare qu&#39;elle n&#39;a pas d&#39;intérêts financiers concurrents. Dr Martin Marque a consulté Seahorse Biosciences, qui produit des instruments et des réactifs utilisés dans le présent article. Les frais d&#39;accès ouvertes pour cet article ont été payés par Seahorse Biosciences.

Acidification extracellulaire est une indication facilement mesurée du taux métabolique cellulaire. Pour déterminer correctement le taux de glycolyse cellulaire (tel que défini par la production de lactate), il est essentiel de connaître le pouvoir tampon du milieu de dosage, et pour convertir les mesures de flux extracellulaires de la consommation d&#39;oxygène et l&#39;acidification Proton taux de production. En effectuant ce calcul, l&#39;acidification résultant de CO 2 libéré dans le cycle de l&#39;acide citrique peut être soustrait, en laissant l&#39;acidification qui résulte de la production de lactate. Les multiples façons différentes données ici pour mesurer la puissance de tampon pour cette correction portent différents avantages et inconvénients. Mesure externe à l&#39;aide d&#39;une sonde de pH est très précise et reproductible, mais peut ne pas refléter de petites différences dans la détection de pH introduit par les fluorophores contenus dans la plaque de dosage, l&#39;addition de composés au cours de l&#39;essai, ou la présence de til cellules elles-mêmes. Le mesures de pH traitent en plaque ces questions, mais aussi introduire des degrés variables de bruit expérimental. La correction de CO 2 à l&#39;ECAR permet pour la première fois le calcul sans équivoque et quantitative des taux de la glycolyse, et révèle la variation de la contribution respiratoire et glycolytique ECAR totale au cours d&#39;une expérience. En utilisant l&#39;équation 5 et les mesures d&#39;OCR, ECAR, et le pouvoir tampon, le taux de la glycolyse peut être calculée en utilisant la simple feuille de calcul fournie (tableau 6). Ce taux peut être vérifiée par la mesure de lactate post-hoc si désiré 6. Dans les cellules où la voie des pentoses phosphates est hautement actif, l&#39;utilisation d&#39;inhibiteurs de la voie tels que le 6-aminonicotinamide peut être utile d&#39;isoler taux glycolytique. Calcul de la contribution de chacun de CO 2 - et le lactate dérivé H + du total mesurées extra cellulaire acidification Coter et oxygène consommatTaux d&#39;ions est un outil précieux pour l&#39;utilisation des données de flux extracellulaires de faire des déclarations puissantes et quantitatives sur l&#39;activité métabolique. En utilisant les procédures décrites ici, y compris les diverses modifications pour mesurer la puissance de tampon, et l&#39;optimisation de l&#39;expérience flux extracellulaire pour les cellules visées par l&#39;enquête et les données souhaitées, le taux de glycolyse dans des cellules intactes peut être quantifiée dans une large gamme de conditions expérimentales. Ce procédé est limité à des cellules qui peuvent croître en culture adhérente (ou sur des cellules ou organites qui peuvent être respectées) une surface de polystyrène. Il est le plus fiable lorsque les cellules cultivées sont homogènes et confluentes, bien que les données utiles peuvent encore être obtenues sur une plage de ces conditions. Les calculs nécessitent une certaine connaissance du métabolisme des cellules, comme Max H + / O 2 gammes de 0,65 à 1,0 pour l&#39;oxydation complète de différents substrats et plus pour oxydation partielle 6, cependant, si les cellules sont known à oxyder le glucose, une valeur de 1,0 peut être présumée. Bien pertinente à tous caractérisation métabolique, ce procédé peut être particulièrement utile lorsqu&#39;il est utilisé dans des systèmes dans lesquels un décalage entre le métabolisme respiratoire et glycolytique pour maintenir l&#39;approvisionnement en ATP cellulaire est un phénotype critique, y compris la caractérisation de cellules souches et de cellules cancéreuses dérivées de tumeurs. La compréhension des modifications de contrôle métabolique dans ces contextes et d&#39;autres permettra à un plus grand degré de sophistication et la précision dans la conception expérimentale et l&#39;analyse de ces types de cellules.

L&#39;objectif global de cette méthode est de mesurer avec précision le taux de la glycolyse des cellules en utilisant l&#39;analyse de flux extracellulaire. La mesure quantitative du taux de la glycolyse en utilisant l&#39;acidification extracellulaire est le point final souhaité de nombreuses expériences. Cependant, le taux global de l&#39;acidification extracellulaire est la somme de deux composantes: l&#39;acidification respiratoire, sous forme de CO 2 (qui hydrate à H 2 CO 3 dissocie alors de HCO 3 - + H +), et de l&#39;acidification de la glycolyse, sous la forme de lactate - + H +. Les contributions de CO 2 à l&#39;acidification extracellulaire totale ont jusqu&#39;à récemment été considéré comme négligeable dans la plate-forme de mesure utilisée ici, l&#39;analyseur XF24 7. Cependant, il est clair dans plusieurs autres systèmes qui CO 2 peut être un contributeur majeur à l&#39;acidification extracellulaire 4-5. Plusieurs documents reconnaissent ce concontribution, mais ne tentez pas de quantification directe de CO 2 -derived 3,8,9 acide. Nous avons récemment démontré que quantitativement production de CO 2 est une source importante de l&#39;acidification extracellulaire dans ce système 6. En outre, bien qu&#39;il existe plusieurs voies métaboliques qui produisent du CO 2 de catabolisme du glucose, celles effectuées par les déshydrogénases de la matrice dans le cycle de l&#39;acide citrique sont les contributeurs écrasante et toutes les autres sources génèrent des quantités de CO 2 qui sont dans l&#39;erreur expérimentale 6. Sans correction de production de CO 2, l&#39;acidification extracellulaire est donc un indicateur ambigu de taux glycolyse et ne peut être utilisée quantitativement. Notre dernière publication met en lumière plusieurs cas où respiratoires CO 2 comprend la majeure partie du signal de l&#39;acidification totale, même dans les cellules croit généralement d&#39;utiliser principalement la glycolyse 6. En outre, lerespiratoires CO 2 contribution à l&#39;acidification totale varie considérablement au cours des expériences de profilage métaboliques communs, ce qui démontre que la comparaison correcte de la vitesse au cours de la glycolyse différentes parties d&#39;une expérience nécessite une correction pour le CO 2. Pour mesurer le taux glycolytique de cellules en utilisant le taux d&#39;acidification extracellulaire, il est nécessaire de convertir des changements de pH à des changements dans totale H + générés, et pour soustraire l&#39;acidification extracellulaire provoquée par CO 2 libéré pendant le fonctionnement du cycle de l&#39;acide citrique. Ici, nous décrivons un procédé simple pour la mesure de la vitesse de production de protons extracellulaire (à partir de changements extracellulaires du pH et de la force calibrée tampon du milieu de dosage) et production de CO 2 (à partir de changements extracellulaires de la concentration en O 2), et montrons comment calculer le taux glycolytique l&#39;utilisation de ces mesures. Cette méthode force<html> ens l&#39;utilité de la mesure de l&#39;acidification extracellulaire en l&#39;utilisant pour calculer correctement le taux glycolytique tel que défini par la production de lactate. Sans correction pour le CO respiratoires 2 (ou mesure directe de lactate), il est impossible de déterminer si et dans quelle mesure le taux d&#39;acidification totale reflète le taux de la glycolyse, confondant l&#39;interprétation des expériences qui utilisent l&#39;acidification extracellulaire totale comme une mesure directe de la production de lactate. CALCULS CO 2 et le lactate sont, dans l&#39;erreur expérimentale, les deux seuls contributeurs à la production d&#39;acide extracellulaire, basées sur des expériences avec des cellules de myoblastes 6. Par conséquent, le taux d&#39;acidification extracellulaire totale (PPR, le taux de production de protons) peut être définie comme: PPR tot = PPR resp + PPR Glyc équation 1 . _content &quot;&gt; où tot = totale; resp = respiratoire; Glyc = glycolytique glycolytique PPR est donc: PPR PPR Glyc = tot - PPR resp équation 2 Ici, PPR tot = ECAR tot / BP équation 3 où ECAR = taux d&#39;acidification extracellulaire (mph / min), et BP = pouvoir tampon (mph / pmol H + à 7 pi), tandis que PPR resp = (10 pH-PK 1 / (1 ​​+ 10 pH-PK 1)) (max H + / O 2) (OCR tot - OCR rot / myx) L&#39;équation 4 où K = une constante d&#39;équilibre de CO 2 combiné hydratation et la dissociation de HCO 3 - + H +; max + H / S 2 = ee CO 2 acidification -derived pour une transformation métabolique particulier tel que l&#39;oxydation complète du glucose 6; OCR = taux d&#39;oxygène de la consommation (pmol de O 2 / min), et OCR rot / myx = non mitochondrial OCR. Equation 4 isolats mitochondrial OCR en soustrayant tout OCR non-mitochondrial (défini comme OCR qui est résistant à la mitochondrial poisons respiratoire roténone et myxothiazol) et représente le maximum H + généré par O 2 consommé pour chaque substrat (max H + / O 2 ) (voir 6), ainsi que la proportion de CO 2 donnant lieu à H + à la température et le pH expérimental (10 pH-PK 1 / (1 ​​+ 10 pH-PK 1). Pour toute oxydation du glucose, de l&#39;oxygène mitochondrial Taux de consommation (OCR) est exactement égal au taux de production de CO 2. Dans le volume d&#39;essai confiné de mesure de flux extracellulaire, CO 2 produitsd par respiration reste piégé dans le milieu d&#39;essai. La majeure partie du CO 2 est piégé hydraté en H 2 CO 3, qui se dissocie ensuite à HCO 3 - + H +. Une petite fraction reste dissous mais pas hydraté, et une autre petite fraction est hydraté mais pas dissocié, comme dicté thermodynamiquement par la constante d&#39;équilibre combiné de CO 2 hydratation et la dissociation de HCO 3 - + H + à la température expérimentale (37 ° C) et le pH (~ 7,4). Ainsi, l&#39;équation complète pour le calcul de PPR g en soustrayant de PPR PPR resp tot est: PPR Glyc = ECAR tot / BP - (10 pH-PK 1 / (1 ​​+ 10 pH-PK 1)) (max H + / O 2) (OCR tot - OCR rot / myx) L&#39;équation 5 jen cette façon, les taux de la respiration et de la glycolyse, ainsi que leur taux de production d&#39;ATP associés, peut être déterminée quantitativement à partir de mesures simples (consommation d&#39;oxygène, acidification extracellulaire, capacité tampon) et l&#39;importation ou le calcul des autres valeurs requises (H + / S 2 , P / S, et la constante d&#39;équilibre K 1) 6. L&#39;expérience décrite ici se développe sur des techniques standard pour utiliser le Flux Analyzer extracellulaire tels que Seahorse XF24 10,11; pour d&#39;autres formats de mesure de flux extracellulaire (par exemple, XF 96 e, ou XFP), tous les volumes ci-dessous devraient être réduites de manière appropriée. Le pouvoir tampon du milieu d&#39;essai peut être mesurée par la construction d&#39;une courbe d&#39;étalonnage, soit directement dans la plate-forme flux extracellulaire ou séparément à l&#39;aide d&#39;une sonde de pH étalonnée. Ici, trois options de mesure de mise en mémoire tampon par le moyen d&#39;analyse de flux sont donnés extracellulaire, y compris en utilisant tous INJECTIsur les ports de l&#39;analyseur de flux extracellulaire avec des puits d&#39;échantillons exempts de cellules, ou en utilisant uniquement le dernier port d&#39;injection dans les puits contenant des cellules (section 1) ou en utilisant une mesure de pH externe (section 2). Voir la feuille de calcul ci-jointe pour les calculs complets de données d&#39;exemple. Pour mesurer la puissance tampon en utilisant la capacité de l&#39;instrument flux extracellulaire pH de détection, il est plus sûr d&#39;utiliser des puits sans cellules afin de minimiser la variation du signal. Cependant, dans l&#39;erreur, aucune différence statistique existe entre les puits lors de la réalisation et cette mesure contenant des cellules exempt de cellules (données non présentées). NOTE: La variation décrit dans l&#39;étape 1.7 comporte l&#39;avantage de rendre compte de tous les changements potentiels à tampon conférés par composés ajoutés ou par la présence de cellules, avec l&#39;inconvénient d&#39;un signal bruyant. Toutefois, comme indiqué ci-dessus, aucune différence significative n&#39;a été trouvée dans le pouvoir tampon calculé entre la conception acellulaire indiqué dans le tableau 1 etla conception post-expérience dans le tableau 2 dans les conditions expérimentales décrites ici. En outre, sur des plages de ApH petites (&lt;0,4 unités; expérimentalement meilleure limités à 0,2 unités), la pente linéaire obtenue en reportant Δ mpH / pmol H + se rapproche de manière adéquate la relation logarithmique entre ApH et [H +]. La pente de cette courbe d&#39;étalonnage représente donc le pouvoir tampon du milieu d&#39;essai dans l&#39;essai de pH / nmol H + dans 7 ul, ou MSP / pmol H + dans 7 ul. Nous recommandons d&#39;augmenter le pouvoir tampon milieu ou en diminuant la densité cellulaire pour les échantillons qui dépassent un changement de 0,2 unité de pH au cours de la durée de mesure. Le temps de mesure peut aussi être diminué, mais cela pourrait réduire le taux d&#39;acidification de l&#39;état d&#39;équilibre et d&#39;introduire des erreurs dans le calcul du taux.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pherastar FS</td>
			<td>BMG</td>
			<td>n/a</td>
			<td>microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF-24</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>n/a</td>
			<td>extracellular flux instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF assay plate</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>V7-PS</td>
			<td>consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl standard</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>38280</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myxothiazol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5580</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbonic anhydrase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2624</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3991</td>
			<td>consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD+</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7004</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement and analysis of extracellular acid production to determine glycolytic rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

<html> La figure 2 montre les données brutes d&#39;une expérience typique. Les 10 derniers points de l&#39;enregistrement à la fois de l&#39;OCR et le pH (ombragée barres verticales) point-à-point de mesure ont été utilisés pour les calculs. Les préoccupations initiales que la valeur moyenne (de mesure de point milieu) de chaque cycle de dosage ne fourniraient pas une résolution suffisante des tarifs pour un calcul précis, d&#39;autant plus qu&#39;il semblait y avoir un léger décalage entre l&#39;addition de port et le taux d&#39;acidification de l&#39;état d&#39;équilibre, ont été pas confirmée, que cela ne semble pas contribuer de manière significative à des erreurs de calcul (non représenté). Alternativement, si la capacité tampon correct est entré lors de l&#39;installation expérimentale, PPR peut être lue directement à partir de la lecture de la collecte des données de l&#39;instrument en affichant la sortie PPR dans le logiciel de l&#39;appareil ou dans le format compatible PC disponible en tant que l&#39;un des paramètres de sortie de données. ftp_upload / 53464 / 53464fig2.jpg &quot;/&gt; Figure 2. Le représentant des traces de flux extracellulaires de O 2 et H +. OCR pH et des traces de l&#39;exemple expérience dans le tableau 5, contenant 10 mM de glucose en début d&#39;essai. Port D a différentes concentrations de HCl pour l&#39;étalonnage de la puissance de mise en mémoire tampon (non représentée sur ces traces moyennées). Les données de la publication précédente 6. Chaque point représente moyenne ± SEM de n = 8 répétitions biologiques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> L&#39;analyse des données des résultats représentatifs Utilisation de la feuille de calcul indiqué dans le tableau 6 et fourni en pièce jointe, les valeurs des données de puits individuels peuvent être entrés dans les colonnes affichées avec en-têtes jaunes. Les six colonnes à<html> le droit sont calculées à partir de ces entrées. L&#39;exemple dans le tableau 6 montre les calculs de PPR et resp Glyc PPR utilisant ECAR et les données OCR des puits individuels pour les conditions natives avec ou sans glucose ajouté, avant Port A plus de oligomycine. Répétitions techniques sur chaque préparation biologique sont normalement la moyenne pour donner des valeurs uniques des sorties dans les quatre dernières colonnes, les données provenant de différentes préparations biologiques sont en moyenne à la propagation appropriée des statistiques d&#39;erreur dans BP et ces quatre valeurs. <img alt="Tableau 6" src="/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg" /> Tableau 6. Calcul de l&#39;appareil respiratoire et de l&#39;acidification de la glycolyse. Colonnes intitulées en jaune indiquent valeurs à entrer de calcul (par exemple, BP, max H + / O 2), ou à partir de la collecte de données (par exemple, l&#39;ECAR tot, OCR).<html> ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table |. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464_Table_6.xlsx">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce tableau comme une feuille de calcul Excel .</a> Contributions de la glycolyse et la respiration à PPR après correction La figure 3 montre la sortie graphique des données calculées comme dans le tableau 6 pour les débits en natif de l&#39;acidification glycolytique et respiratoire, les taux suivants oligomycine plus (Port A), et les taux suivants plus FCCP (Port B). Ces données démontrent clairement comment les proportions du changement d&#39;acidification respiratoire et de la glycolyse avec choix du substrat (glucose par rapport au témoin (CTL) avec aucun ajoutés) et avec le statut mitochondrial (fonction native vs fonction pharmacologiquement altérée). &quot;&gt; <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53464/53464fig3.jpg" /> Figure 3. Taux Proton de production (PPR) à partir de sources de la glycolyse et respiratoires. PPR provenant de la respiration (Les parties ouvertes) et de la glycolyse (des parties remplies) des cellules C2C12 calculées selon l&#39;équation 5 avec du glucose ajoutée (trois barres de gauche) ou sans glucose ajoutée (trois barres à droite). Les données de six. Toutes les données représentent la moyenne ± SEM de n = 8 répétitions biologiques.

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Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Mesure et analyse de la production extracellulaire acide pour Déterminer glycolytique Taux

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

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Research

JoVE Journal

Biology

24.9K vues.  Touro University California College of Pharmacy. Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

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Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Mesure quantitative de invadopodes la protéolyse matrice extracellulaire dans des contextes simples et multicellulaire

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Recherche

Biologie

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Une méthode à haut débit pour la mesure de débit de filtration glomérulaire chez des souris conscientes

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Mesure des taux métabolique dans<em&gt; Drosophila</em&gt; En utilisant Respirométrie

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Mesure de extracellulaire Ion flux Utilisation de l&#39;Ion sélectif microélectrodes Technique d&#39;auto-référencement

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human disease in this organism. Sensitive methods for measurements of parameters such as metabolic rates are needed to drive the understanding of physiology and disease in small animals such as the fruit fly. The method described here assesses fuel oxidation in small numbers of adult flies fed food containing trace amounts of 14C-labeled substrates such as glucose or fatty acid. After the feeding period and any additional experimental manipulations, flies are transferred to short tubes capped with mesh, which are then placed in glass vials containing KOH-saturated filter paper that traps exhaled, radiolabeled CO2 generated from oxidation of radiolabeled substrates as potassium bicarbonate, KHCO3. This radiolabeled bicarbonate is measured by scintillation counting. This is a quantitative, reproducible, and simple approach for the study of fuel oxidation. The use of radiolabeled glucose, fatty acids, or amino acids allows determination of the contribution of these different fuel sources to energy metabolism under different conditions such as feeding and fasting and in different genetic backgrounds. This complements other approaches used to measure in vivo energy metabolism and should further the understanding of metabolic regulation.

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

Mesure de dioxyde de carbone de production de radiomarqué Substrats en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Mesure du métabolisme énergétique chez Explanté tissu rétinien en utilisant l’analyse de Flux extracellulaire

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

Analyse par cytométrie en flux de vésicules extracellulaires de médias conditionné par cellule d’écoulement

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Purification et analyse de Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

Analyse de suivi des nanoparticules pour la quantification et la détermination de la taille des vésicules extracellulaires

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically estimated on solidified media by comparing colony size. However, to quantitatively measure the growth rate of genetically different fungal strains or strains under different environmental/growth conditions (pH, temperature, carbon and nitrogen sources, antibiotics, etc.) is challenging. Thus, the pursuit of complementary approaches to quantify growth kinetics becomes mandatory in order to better understand fungal cell growth. Furthermore, it is well-known that filamentous fungi, including Aspergillus spp., have distinct modes of growth and differentiation under sub-aerial conditions on solid media or submerged cultures. Here, we detail a quantitative microscopic method for analyzing growth kinetics of&#160;the model fungus Aspergillus nidulans, using live imaging in both submerged cultures and solid media. We capture images, analyze, and quantify growth rates of different fungal strains in a reproducible and reliable manner using an open source, free software for bio-images (e.g., Fiji), in a way that does not require any prior image analysis expertise from the user.

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

We present a label-free live imaging protocol using transmitted light microscopy techniques to capture images, analyze and quantify growth kinetics of the filamentous fungus A. nidulans in both submerged cultures and solid media. This protocol can be used in conjunction with fluorescence microscopy.

Analyse quantitative du taux de croissance d’Aspergillus nidulans à l’aide de la microscopie en direct et d’un logiciel open source

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...