L’hybridation in situ est une technique très instructive pour présenter les modèles d’expression de l’ARNm et de l’ARN inc. de gènes spécifiques dans les tissus. Notre but dans cet article est de développer une méthode sensible pour détecter la localisation spécifique de l’ARNm dans le fluide coélomic de Sipunculus nudus, qui est une ressource de pêche cruciale. Nous avons présenté les résultats représentatifs obtenus de nos expériences réussies en utilisant cette méthode.
Nous espérons que notre méthode s’appliquera à d’autres espèces de Sipuncula pour identifier les modèles d’expression de l’ARNm spécifique et de l’ARN incelomic dans le fluide coélomic. Fixer le Nudus Sipunculus sur la table de dissection. Ouvrez le corps du Nudus sipunculus avec de petits ciseaux autoclavés.
Puis recueillir et transférer le fluide coélomic avec pipette à poly-D-lysine diapositives microscope traités, répartis légèrement. Séchez à l’air les toboggans pendant une heure à 37 degrés Celsius. Lavez les toboggans avec dePC-PBS pendant trois fois, cinq minutes par lavage avec une agitation douce.
Égoutter le PBS, ajouter la solution proteinase K sur les glissières pendant cinq minutes à température ambiante. Égoutter la solution proteinase K. Ajouter la solution PFA sur les glissières pendant 20 minutes à température ambiante.
Égoutter la solution PFA. Lavez les toboggans avec dePC-PBS pendant trois fois, cinq minutes par lavage avec une agitation douce. Égoutter le PBS.
Ajouter 50 microlitres riboprobe. Ajouter un coverslip. Mettez les glissières dans la boîte humide et scellez bien avec du film de paraffine.
Hybrider toute la nuit à 60 degrés Celsius. Immergez les glissières dans le tampon de lavage et laissez-les reposer jusqu’à ce que le coverslip glisse automatiquement. Lavez les toboggans avec le tampon de lavage préchauffé pendant deux fois à 65 degrés Celsius, 30 minutes par lavage avec une agitation douce.
Lavez les glissières avec la solution SSC préchauffée pendant deux fois à 65 degrés Celsius, 30 minutes par lavage avec une légère agitation. Lavez les glissières avec la solution MABT deux fois à température ambiante. 30 minutes par lavage avec agitation douce.
Égoutter le MABT. Ajouter le tampon de blocage. Incuber les toboggans à température ambiante pendant trois à quatre heures.
Égoutter le tampon de blocage. Ajouter l’anticorps, incuber les glissières à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Égoutter la solution anticorps.
Lavez les toboggans avec la solution MABT quatre fois, 25 minutes par lavage avec une agitation douce. Égoutter le MABT. Ajouter le tampon de phosphatase alcalin pendant trois fois, cinq minutes par incubation.
Retirez le tampon de phosphatase alcaline. Ajoutez la solution de coloration BCIP-NBT. Gardez les diapositives dans le noir.
Le temps de coloration varie de minutes en heures, même pendant la nuit, ce qui dépend de l’intensité du signal. L’état de coloration doit être vérifié plus fréquemment au début de la coloration. Par exemple, avec un intervalle de plusieurs minutes, et plusieurs heures au plus tard de la coloration.
Le temps de vérification doit être aussi court qu’il peut l’être pour éviter d’introduire une signalisation de fond élevée en raison de l’exposition à la lumière. Les signaux représentatifs d’hybridation in situ sont affichés. L’hybridation in situ du liquide coelomic de Sipunculus nudus avec le riboprobe anti-sens qui cible dmrt1 indique la coloration pourpre concentrée dans les cellules trophoblastes du spermatozeugmata, de la figure 2A et du riboprobe de B.Sense pour dmrt1 n’a détecté aucun signal d’hybridation, figure 2C.
Après avoir regardé cette vidéo, vous auriez une très bonne compréhension de la façon de visualiser les modèles d’expression de l’ARNm cible ou IncRNA dans le fluide coélomic de Sipunculus nudus.
