Le soutien financier de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), la formation à la recherche Groupe GRK 2039 (financé par DFG) et KIT est grandement apprécié.

Attention: S&#39;il vous plaît consulter toutes les fiches de données de sécurité des matériaux pertinents (MSDS) avant utilisation. Plusieurs des produits chimiques utilisés dans ces synthèses sont toxiques et cancérigènes. S&#39;il vous plaît utiliser toutes les pratiques de sécurité appropriées qui sont généralement nécessaires dans les laboratoires de chimie organique, comme le port d&#39;une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants. 1. Synthèse des colorants Remarque: Les deux colorants peuvent être synthétisés par les mêmes types de réaction Figure 2 montre une vue d&#39; ensemble de ces réactions.. <ol><li> Synthèse de la 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-méthyl-1H-indol-3-yl) vinyl) pyridine-1-ium (colorant 1) <ol><li> Synthèse de la 1- (3-iodopropyl) -4-méthylpyridine-1-ium (figure 2A, l&#39; étape a) <ol><li> Dissoudre 466 mg de 4-picoline et 5,91 g de 1,3-diiodopropane dans 10 ml d&#39;acétonitrile dans un flacon de 20 ml d&#39;espace de tête et sceller hermétiquement par un bouchon à septum. </li><li> Chauffer jusqu&#39;à 85 ° C pendant 16 heures. </li><li> Laisser refroidir à la température ambiante, puis éliminer le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif. </li><li> Ajouter 20 ml d&#39;acétate d&#39;éthyle à l&#39;huile résiduelle et traiter le mélange dans un bain de 120 W à ultrasons pendant 3 minutes. </li><li> Recueillir le précipité formé par filtration et lavage cinq fois avec de l&#39;acétate d&#39;éthyle. Sécher le produit solide sous vide O / N. </li></ol></li><li> Synthèse de la 1- (3-azidopropyl) -4-méthylpyridine-1-ium (figure 2A, l&#39; étape b) <ol><li> Dissoudre 900 mg de 1- (3-iodopropyl) -4-méthylpyridine-1-ium dans 12 ml d&#39;acétonitrile dans un flacon de 20 ml d&#39;espace de tête, ajouter 376 mg d&#39;azoture de sodium, et de sceller hermétiquement par un bouchon à septum. </li><li> Chauffer jusqu&#39;à 85 ° C pendant 16 heures. </li><li> Laisser refroidir à la température ambiante, puis éliminer le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif. </li><li> Ajouter 15 ml de dichlorométhane au résidu. </li><li> Filtrez et jeter le précipité résultant. </li><li> On élimine le solvant sous pression réduite en utilisant une pourritureaire évaporateur pour obtenir le produit sous forme d&#39;huile brune. </li></ol></li><li> Synthèse de la 1-méthyl-1H-indole-3-carbaldéhyde (figure 2A, l&#39; étape c) <ol><li> Sous gaz inerte (argon), on dissout 1,45 g d&#39;indole-3-carbaldéhyde, 1,52 g de carbonate de potassium et 2,70 g de carbonate de diméthyle dans 10 ml de diméthylformamide anhydre dans un ballon de 50 ml équipé d&#39;un condenseur à reflux à fond rond. </li><li> Incorporer le mélange à 130 ° C pendant 19 heures. </li><li> Laisser refroidir à la température ambiante, puis versez le mélange sur la glace. </li><li> On extrait la couche aqueuse à trois reprises avec 150 ml d&#39;acétate d&#39;éthyle. </li><li> Combiner les couches organiques, les laver avec de l&#39;eau, les sécher sur du sulfate de sodium et éliminer le solvant à 50 ° C sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif. </li></ol></li><li> Le couplage à la 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-méthyl-1H-indol-3-yl) vinyl) pyridine-1-ium (colorant 1) (figure 2A, l&#39; étape d) <ol><li> Travailler sous atmosphère d&#39;argon et à l&#39;abri de l&#39;humidité. Dissolve 90 mg de 1- (3-azidopropyl) -4-méthylpyridine-1-ium et de 48 mg de 1-méthyl-1H-indole-3-carbaldéhyde dans 4 ml d&#39;éthanol dans un flacon de 20 ml équipé d&#39;un condenseur à reflux à fond rond. </li><li> Ajouter 0,07 ml de pipéridine et on chauffe à 80 ° C pendant 4 heures. </li><li> Laisser refroidir à température ambiante. </li><li> Recueillir le précipité résultant par filtration et laver trois fois avec de l&#39;éther diéthylique. </li><li> Ajouter de l&#39;éther diéthylique au surnageant et recueillir le précipité résultant par filtration. Laver trois fois avec du diéthyléther. </li><li> Combinez les précipités. </li></ol></li></ol></li><li> Synthèse de la 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-méthyl-2-phényl-1H-indol-3-yl) vinyl) quinoléin-1-ium (colorant 2) <ol><li> Synthèse de la 1- (3-iodopropyl) -4-méthylquinoléine-1-ium (figure 2B, l&#39; étape a) <ol><li> Dissoudre 715 mg de 4-méthyl-quinoléine et 5,91 g de 1,3-diiodopropane dans 10 ml d&#39;acétonitrile dans un flacon de 20 ml d&#39;espace de tête et sceller hermétiquement par un bouchon à septum. </li><li> Chaleurà 85 ° C pendant 16 heures. </li><li> Laisser refroidir à la température ambiante, puis éliminer le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif. </li><li> Ajouter 20 ml d&#39;acétate d&#39;éthyle à l&#39;huile restante et traiter le mélange dans un bain de 120 W à ultrasons pendant 3 minutes. </li><li> Recueillir le précipité formé par filtration et lavage cinq fois avec de l&#39;acétate d&#39;éthyle. Sécher le produit solide sous vide O / N. </li></ol></li><li> Synthèse de la 1- (3-azidopropyl) -4-méthylquinoléine-1-ium (figure 2B, l&#39; étape b) <ol><li> Dissoudre 900 mg de 1- (3-iodopropyl) -4-méthylquinoléine-1-ium dans 12 ml d&#39;acétonitrile dans un flacon de 20 ml d&#39;espace de tête, ajouter 333 mg d&#39;azoture de sodium, et de sceller hermétiquement par un bouchon à septum. </li><li> Chauffer jusqu&#39;à 85 ° C pendant 16 heures. </li><li> Laisser refroidir à la température ambiante, puis éliminer le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif. </li><li> Ajouter 15 ml de dichlorométhane au résidu. </li><li> Filtrez et jeter le précipité résultant. </li><li> Retirez le u solvantelon pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif pour obtenir le produit sous forme d&#39;huile brune. </li></ol></li><li> Synthèse de la 1-méthyl-2-phényl-1H-indole-3-carbaldéhyde (figure 2B, l&#39; étape c) <ol><li> Sous gaz inerte (argon), on dissout 1,45 g de 2-phényl-1H-indole-3-carbaldéhyde, 0,996 g de carbonate de potassium et 1,77 g de carbonate de diméthyle dans 10 ml de diméthylformamide anhydre dans un ballon de 50 ml équipé d&#39;un condenseur à reflux à fond rond. </li><li> Incorporer le mélange à 130 ° C pendant 19 heures. </li><li> Laisser refroidir à la température ambiante, puis versez le mélange sur la glace. </li><li> On extrait la couche aqueuse à trois reprises avec 150 ml d&#39;acétate d&#39;éthyle. </li><li> Combiner les couches organiques, les laver avec de l&#39;eau, les sécher sur du sulfate de sodium et éliminer le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif. </li></ol></li><li> Le couplage à la 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-méthyl-2-phenyl-1H-indol-3-yl) vinyl) quinoléin-1-ium (figure 2B, l&#39; étape d) <ol><li> Travailler sous arget à l&#39;abri de l&#39;humidité. Dissoudre 90 mg de 1- (3-azidopropyl) -4-méthylquinoléine-1-ium et 59,7 mg de 1-méthyl-2-phényl-1H-indole-3-carbaldéhyde dans 4 ml d&#39;éthanol dans un ballon de 20 ml à fond rond équipé avec un condenseur à reflux. </li><li> Ajouter 0,06 ml de pipéridine et on chauffe à 80 ° C pendant 4 heures. </li><li> Laisser refroidir à température ambiante. </li><li> Recueillir le précipité résultant par filtration et laver avec du diéthyléther trois fois. </li><li> Ajouter de l&#39;éther diéthylique au surnageant et recueillir le précipité résultant par filtration. Laver trois fois avec du diéthyléther. </li><li> Combinez les précipités. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Synthèse des brins d&#39;ADN Remarque: La synthèse des brins d&#39;ADN est effectuée en utilisant la méthode au phosphoramidite en phase solide, comme décrit par M. Caruthers 11 sur un synthétiseur d&#39;ADN. Le fonctionnement du synthétiseur est testé avant la procédure de synthèse, et les réactifs sont renouvelés sinécessaire. <ol><li> préarrangements <ol><li> Dissoudre le 2&#39;-O-propargyl-deoxyuridinephosphoramidite disponible dans le commerce (Cu) dans 1,2 ml de diluant amidite (acétonitrile extra-sec). Déplacer solution dans le flacon à un flacon de synthétiseur et visser dans le synthétiseur. </li><li> Effectuer un &quot;test de fuite» (selon les instructions du fabricant) pour vous assurer qu&#39;aucune fuite de gaz d&#39;argon existe. Si le &quot;test de fuite&quot; échoue, visser dans le flacon plus étroitement. </li><li> Amorçage de la solution cU en remplissant le tube qui relie la chambre de synthèse en phase solide. </li><li> Lavez toutes les lignes avec de l&#39;acétonitrile. </li></ol></li><li> La synthèse des brins d&#39;ADN <ol><li> Utiliser l&#39;ordinateur connecté à entrer dans la méthode de la séquence d&#39;ADN et de couplage, en suivant les instructions du protocole du fabricant. L&#39;étape de couplage du bloc de construction cU prend 168 secondes avec 7 impulsions (chaque impulsion sont 16 pi) par rapport à 40 sec avec 7 impulsions pour un classiquephosphoramidite en tant que blocs de construction. </li><li> Monter la colonne contenant la CPG (verre à pores contrôlés) en tant que phase solide, qui est modifié avec 1 umole de la première base (synthèse de l&#39;ADN est réalisée à partir de 3 &#39;à 5&#39;) dans le synthétiseur. </li><li> Lancer la synthèse sur le synthétiseur d&#39;ADN 11. </li></ol></li><li> Le traitement des brins d&#39;ADN synthétisés <ol><li> Sécher les colonnes avec les brins d&#39;ADN synthétisés sous vide O / N. </li><li> Utilisez une pince pour ouvrir la colonne et libérer le CPG dans un flacon de réaction. Ajouter 700 ul d&#39;une solution aqueuse concentrée d&#39;ammoniac pour déprotéger l&#39;oligonucléotide et de libérer le brin d&#39;ADN à partir de la CPG. </li><li> Fermer le flacon et appliquer un couvercle de sécurité sur le récipient de réaction pour l&#39;empêcher d&#39;éclater, et on chauffe à 50 ° C pendant 18 heures. </li><li> Éliminer l&#39;ammoniac par centrifugation sous pression réduite (100 mbar) à 30 ° C pendant 30 min. </li><li> Lancer la filtration du CPG: navire Centrifugeuse à 11.000 xg foR 3 min. Prendre surnageant et on la transfère dans un dispositif centrifuge avec une taille de pores de 0,45 pm. Centrifuger à 1000 g pendant 4 min. </li><li> ajouter Pendant ce temps 300 pi d&#39;eau distillée deux fois à la CPG, vortex pendant 20 secondes et centrifuger à 11 000 xg pendant 3 min. Transférer le surnageant dans le dispositif centrifuge et centrifuger à 1000 g pendant 4 min. Répéter deux fois cette procédure de lavage. </li><li> Enlever l&#39;eau à partir des solutions aqueuses rassemblées par centrifugation à 0,1 mbar et 25 ° CO / N. </li></ol></li></ol> 3. &quot;En cliquant sur&quot; Procédure <ol><li> Ajouter 50 ul d&#39;eau bidistillée et 25 pl d&#39;une solution d&#39;ascorbate de sodium (0,4 M dans l&#39;eau), 34 ul de tris - [(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) méthyl] amine (0,1 M dans du DMSO / tBuOH 3: 1), 114 pl de l&#39;azoture (0,01 M dans du DMSO / tBuOH 3: 1) et 17 ul d&#39;un tétrakis (acétonitrile) cuivre () solution de l&#39;hexafluorophosphate I (0,1 M dans du DMSO / tBuOH 3: 1) à l&#39;échantillon d&#39;ADN modifié par alcyne lyophilisée. </li&gt; <li> Incuber l&#39;échantillon à 60 ° C pendant 1,5 heure. </li><li> Laisser refroidir à température ambiante. </li><li> Ajouter 150 ul de Na 2 EDTA (0,05 M dans l&#39; eau) et 450 ul d&#39; acétate de sodium (0,3 M dans l&#39; eau) à l&#39;échantillon d&#39;ADN et la transférer dans un tube de 10 ml. </li><li> Ajouter 10 ml d&#39;éthanol (100%) et la maintenir au -32 ° C pendant 16 heures. </li><li> Centrifugeuse navire pendant 15 min à 1000 xg et retirer le surnageant. </li><li> Laver l&#39;ADN culot avec 2 ml d&#39;éthanol froid (80%). </li><li> culot sec sous pression réduite. </li></ol> 4. Purification HPLC Note: Avant de séparer les brins d&#39;ADN assurez-vous que la HPLC fonctionne correctement, suffisamment de solvant est disponible et la colonne est propre. Rincer la colonne avec la concentration à partir de tampon / acétonitrile. <ol><li> Dissoudre l&#39;ADN-pellet brut dans 250 ul d&#39;eau bidistillée et le transfert à un flacon de HPLC. </li><li> Début HPLC course de 45 min avec un gradient de 0% d&#39;acétonitrile à 15% d&#39;acétonitrile pour colorant 1 et un gradi<html> ent de 0% d&#39;acétonitrile à 17% d&#39;acétonitrile pour la teinture 2. Surveiller la course en vérifiant 260 nm (absorption d&#39;ADN) et 459 nm (colorant 1) ou 542 nm (colorant 2). Recueillir les fractions qui montrent l&#39;absorption dans les deux canaux de longueur d&#39;onde. </li><li> Vérifiez les fractions collectées pour le droit de masse par matrice désorption laser assistée par ionisation (MALDI) spectrométrie de masse en utilisant une matrice constituée de 3-hydroxypicolinique acide (3hPa) et diammoniumhydrogencitrate. <ol><li> Préparer la matrice en mélangeant 900 ul d&#39;une solution saturée de 3-HPA 1: 1 mélange d&#39;acétonitrile et d&#39;eau avec 100 ul d&#39;une solution de diammoniumhydrogencitrate (100 g / L) dans l&#39;eau. </li><li> Pipeter 1-2 pi de la sonde d&#39;ADN sur la cible et le laisser sécher à l&#39;air. </li><li> Ajouter 0,2 ul de la matrice 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate à l&#39;échantillon et mélanger jusqu&#39;à ce qu&#39;il cristallise. </li><li> Effectuer la spectrométrie de masse MALDI. </li><li> Combiner les fractions de CLHP qui présentent le droit de masse. </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 5. Détermination de la concentration Remarque: La concentration est déterminée en mesurant l&#39;absorption à 260 nm en utilisant un spectrophotomètre UV / VIS, sur la base des coefficients d&#39;extinction (ε 260) des bases de l&#39; ADN et le colorant. <ol><li> Dissoudre l&#39;ADN dans 100 - 200 ul doublement eau distillée. </li><li> Appliquer 1 pi de la solution d&#39;ADN sur le spectrophotomètre UV / VIS. </li><li> Mesurer l&#39;absorption à 260 nm. Répétez trois fois. </li><li> Prenez la valeur moyenne pour calculer la concentration de la solution. Pour le calcul des coefficients d&#39;extinction, utilisez ε 260nm des quatre bases naturelles 12 et 260nm de ε du cU de bloc de construction acheté (considérée comme uridine naturelle) 12 pour obtenir le 260nm de ε de l&#39;ensemble du brin d&#39;ADN. Pour colorant 1, l&#39; utilisation ε 260nm = 10200 L * mol -1 * cm pour les colorants 2, l&#39; utilisation ε 260nm = 13100 L * mol -1 et &lt;sup&gt; -1 * cm -1. Calculer la concentration de la solution suivant la loi de Lambert-Beers sur la base des coefficients d&#39;extinction et les absorbances mesurées. 13 </li></ol> 6. Préparation des échantillons et Spectroscopie <ol><li> Préparation des échantillons de simple brin <ol><li> Préparer séparément 1 ml de solution à 2,5 uM de chacune des ADN1 modifiée et ADN2 dans 200 mM de NaCl, 50 mM de NaP i, pH = 7. </li></ol></li><li> Préparation des échantillons double brin <ol><li> Préparer 1 ml d&#39;une solution contenant 2,5 uM de ADN1 et 2,5 uM de ADN2 dans 200 mM de NaCl, 50 mM de NaP i, pH = 7 dans un récipient de réaction. </li><li> Fixer le couvercle avec un bouchon de sécurité et de la chaleur à 90 ° C pendant 10 min. Ensuite, éteignez le chauffage et laisser refroidir à la température ambiante O / N. </li></ol></li><li> La spectroscopie d&#39;absorption Remarque: Pour déterminer la longueur d&#39;onde d&#39;excitation pour la spécification de fluorescenceLes spectres d&#39;absorption spectroscopie sont enregistrés. <ol><li> Torons mesures simples <ol><li> Enregistrement d&#39; une mesure à blanc ne contenant que 200 mM de NaCl, mM NaP 50 i, pH = 7. </li><li> Transférer la solution préparée de ADN1 dans une cuvette de 1 cm en verre de quartz et d&#39;enregistrer l&#39;absorption. Corrigez la mesure par rapport aux données vierges. Déterminer la valeur maximale d&#39;absorption du colorant. </li><li> Répétez l&#39;opération pour ADN2. </li></ol></li></ol></li><li> La spectroscopie de fluorescence <ol><li> Torons mesures simples <ol><li> Enregistrement d&#39; une mesure à blanc contenant mM de NaCl à 200 mM , NaP 50 i, pH = 7; en utilisant la longueur d&#39;onde d&#39;excitation du colorant 1. </li><li> Transférer la solution de ADN1 dans une cuvette de 1 cm en verre de quartz. </li><li> Relever le spectre de fluorescence. </li></ol></li><li> Double mesure brin <ol><li> Transférer la solution double brin dans une cuvette de verre de quartz. </li&gt; <li> Enregistrer le spectre de fluorescence en utilisant la longueur d&#39;onde d&#39;excitation du colorant 1. </li></ol></li></ol></li><li> Expériences de visualisation Attention: une protection oculaire appropriée doit être portée pour éviter les dommages UV pour les yeux! <ol><li> Pour obtenir une meilleure compréhension de ce que les spectres enregistrés montrent, irradier les cuvettes avec lampes UV de poche (figure 5). Observez le changement de couleur de fluorescence de la seule à l&#39;ADN double brin. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Ce protocole montre la procédure complète pour marquer l&#39;ADN post-synthétiquement via CuAAC par des colorants fluorescents azoture modifié. Cela comprend la synthèse des colorants et de l&#39;ADN modifié par alcyne ainsi que la procédure d&#39;étiquetage. La synthèse des colorants en quatre étapes. Tous les produits peuvent être obtenus par une précipitation assez simple en raison de leur charge positive et pas de temps Chromatographie sur colonne est nécessaire. L&#39;intro...

L&#39; imagerie moléculaire représente une technique fondamentale pour la compréhension des processus biologiques dans les cellules vivantes. 1-3 Le développement de sondes fluorescentes d&#39;acides nucléiques sur la base de ces applications chimiques et biologiques est devenu un domaine de recherche en pleine expansion. Ces sondes fluorescentes doivent répondre à quelques exigences pour devenir des outils appropriés pour l&#39;imagerie cellulaire. Tout d&#39; abord, les colorants appliqués doivent présenter une fluorescence avec des rendements quantiques élevés, les changements de grande Stokes et, surtout, de hauts photostabilities pour permettre à long terme dans l&#39; imagerie in vivo. Et deuxièmement, ils doivent montrer une lecture de fluorescence fiable. Conventionnel chromophore-quencher-systèmes sont basés sur la lecture d&#39;une seule couleur de fluorescence par de simples changements dans l&#39; intensité de fluorescence. 4 Cette approche porte le risque de résultats faussement positifs ou faussement négatifs en raison de l&#39; autofluorescence des composants intracellulaires ou faibles rapports signal sur bruit en raison de l&#39;extinction indésirable par d&#39;autres composants. 4 Nous avons récemment rapporté sur le concept de &quot;feux d&#39;ADN&quot; qui montrent deux lectures de couleurs de fluorescence en utilisant deux chromophores différents. 5-6 Le concept est basé sur le transfert d&#39;énergie (ET) à partir du donneur de colorant au colorant accepteur qui modifie la fluorescence couleur (voir Figure 1). Ceci permet une lecture plus fiable et fournit ainsi un outil puissant pour les sondes d&#39;imagerie fluorescentes. L&#39;étiquetage des oligonucléotides avec des colorants fluorescents peut être réalisée par deux méthodes différentes. Des colorants peuvent être incorporés lors de la synthèse chimique d&#39;ADN sur une phase solide en utilisant des blocs de construction des phosphoramidites modifiés en conséquence. 7 Cette méthode est limitée aux colorants qui sont stables dans des conditions de phosphoramidite et de déprotection standard. En variante, les méthodes de modification post-synthèse ont été établies dans la chimie des oligonucléotides. Ici, nous démontrons la synthèse d&#39;un de nos nouvelles photosl&#39; énergie de table paires de transfert 8,9 et l&#39;étiquetage post-synthétique de l&#39; ADN en utilisant le cuivre catalysée 1,3-cycloaddition entre azides et alcynes (CuAAC). 10

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="885">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:409px;">synthesis</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Picoline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>239615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1,3-Diiodopropane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>238414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10660131</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethyl acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10456870</td>
			<td>technical grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71290</td>
			<td>p.a. grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dichloromethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10626642</td>
			<td>technical grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Indole-3-carboxaldehyde; 98%</td>
			<td>ABCR</td>
			<td>AB112969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium carbonate, 99+%</td>
			<td>Acros</td>
			<td>424081000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dimethylcarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>517127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348435000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium sulfate</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>12623.46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, 99.5%</td>
			<td>Acros</td>
			<td>397690010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Piperidine, 99%</td>
			<td>Acros</td>
			<td>147181000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diethylether</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10407830</td>
			<td>technical grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97%</td>
			<td>ABCR</td>
			<td>AB125050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Methylquinoline</td>
			<td>ABCR</td>
			<td>AB117222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMT-dA(bz) Phosphoramidite</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A111081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMT-dT Phosphoramidite</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T111081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMT-dG(dmf) Phosphoramidite</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G11508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMT-dC(bz) Phosphoramidite</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C11108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amidite Diluent for DNA synthesis</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L010400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cap A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L840000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cap B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L850000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CPG dT Column 1.0 &#181;mole</td>
			<td>Proligo Reagents</td>
			<td>T461010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CPG dA(bz) Column 1.0 &#181;mole</td>
			<td>Proligo Reagents</td>
			<td>A461010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CPG dG(ib) Column 1.0 &#181;mole</td>
			<td>Proligo Reagents</td>
			<td>G461010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CPG dC(bz) Column 1.0 &#181;mole</td>
			<td>Proligo Reagents</td>
			<td>C461010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ammonia (aqueous solution)&#160;</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>318612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifugal devices nanosep 0.45 &#181;m</td>
			<td>Pall</td>
			<td>ODGHPC34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2&#39;-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite</td>
			<td>Chem Genes</td>
			<td>ANP-7754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">workup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">vacuum concentrator</td>
			<td>Christ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">clicking procedure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>346276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA disodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TBTA-ligand</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>synthesized according to a literature procedure [1]</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPLC-system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MALDI-Biflex-IV spectrometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LC-318 C18 column</td>
			<td>Supelcosil via Sigma Aldrich</td>
			<td>58368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">determination of concentration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ND 1000 Spectrophotometer</td>
			<td>nanodrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sample preparation and spectroscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cary 100 Bio</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluoromax-3 fluorimeter</td>
			<td>Jobin-Yvon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:409px;">[1] R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of wavelength-shifting dna hybridization probes by using photostable cyanine dyes

Dans ce protocole, nous démontrons une méthode pour la synthèse de 2&#39;-alcyne modifié acide désoxyribonucléique (ADN) brins par synthèse en phase solide automatisée en utilisant la chimie phosphoramidite standard. Les oligonucléotides sont post-synthétiquement marqués par deux nouveaux colorants de cyanine photostable en utilisant le cuivre catalysée par un clic-chimie. La synthèse du donneur et accepteur de colorant est décrit et est réalisée en trois étapes consécutives. Avec l&#39;ADN que l&#39;architecture environnante, ces deux colorants sont soumis à un transfert d&#39;énergie quand ils sont amenés en étroite proximité par hybridation. Par conséquent, le recuit des deux brins d&#39;ADN simple brin est visualisée par un changement de couleur de la fluorescence. Ce changement de couleur est caractérisé par spectroscopie de fluorescence, mais peut aussi être directement observée à l&#39;aide d&#39;un rayonnement ultraviolet de poche (UV), la lampe. Le concept d&#39;une double lecture de la couleur de fluorescence rend ces sondes d&#39;oligonucléotides d&#39;excellents outils pour l&#39;imagerie moléculaire en particulier lorsque le pho décrittostable colorants sont utilisés. De ce fait, le photoblanchiment des sondes d&#39;imagerie est empêchée, et les processus biologiques peuvent être observées en temps réel pendant une période de temps plus longue.

Absorption et spectres de fluorescence de l&#39;ADN simple et double brin sont enregistrés comme le montre la figure 4. Les spectres d&#39;absorption enregistrés (figure 4 à droite) montrent maxima d&#39; absorption λ max à 465 nm pour ADN1 simple brin (colorant 1) et 546 nm pour ADN2 simple brin (colorant 2). Le DNA1_2 recuite (colorant 1 &amp; colorant 2) montre des maxima à...

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Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Synthèse de la longueur d&#39;onde de décalage d&#39;ADN à l&#39;aide de sondes d&#39;hybridation cyanine photostable

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

synthesis-wavelength-shifting-dna-hybridization-probes-using

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11.0K vues.  Karlsruhe Institute of Technology. Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Vidéo: Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of almost all intracellular signaling. Moreover, they play an important role in environmental adaptation and drug treatment, and are often involved in disease pathogenesis and pathology (1). Protein-protein interactions are intrinsic to signaling pathways, and to gain more insight in these complex biological processes, sensitive and reliable methods are needed for studying cell surface proteins. Two-dimensional (2-D) electrophoresis is used extensively for detection of biomarkers and other targets in complex protein samples to study differential changes. Cell surface proteins, partly due to their low abundance (1 2% of cellular proteins), are difficult to detect in a 2-D gel without fractionation or some other type of enrichment. They are also often poorly represented in 2-D gels due to their hydrophobic nature and high molecular weight (2). In this study, we present a new protocol for intact cells using CyDye  DIGE Fluor minimal dyes for specific labeling and detection of this important group of proteins. The results showed specific labeling of a large number of cell surface proteins with minimal labeling of intracellular proteins. This protocol is rapid, simple to use, and all three CyDye DIGE Fluor minimal dyes (Cy 2, Cy 3 and Cy 5) can be used to label cell-surface proteins. These features allow for multiplexing using the 2-D Fluorescence Difference Gel Electrophoresis (2-D DIGE) with Ettan  DIGE technology and analysis of protein expression changes using DeCyder  2-D Differential Analysis Software. The level of cell-surface proteins was followed during serum starvation of CHO cells for various lengths of time (see Table 1). Small changes in abundance were detected with high accuracy, and results are supported by defined statistical methods.

A simple and specific method was demonstrated for fluorescent labeling and enhanced detection of cell surface proteins without a fractionation step. Differential abundance in cell surface proteins was analyzed using two-dimensional (2-D) electrophoresis and Ettan&#x2122; DIGE technology.

Étiquetage sélective des protéines de surface cellulaire utilisant CyDye DIGE Fluor Colorants Minimal

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Recherche

Biologie

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Génération d&#39;ADN / ARN hybrides d&#39;ADN génomique par la transformation en utilisant l&#39;ARN contenant Oligonucléotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

Cellules souches: le contrôle qualité des échantillons, hybridation Array et balayage

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. Lipid rafts are membrane microdomains enriched in cholesterol and sphingolipids. They play a role in cellular physiological processes such as signalling, and trafficking1,2 but are also thought to be key players in several diseases including viral or bacterial infections and neurodegenerative diseases3.
Yet their existence is still a matter of controversy4,5. Indeed, lipid raft size has been estimated to be around 20 nm6, far under the resolution limit of conventional microscopy (around 200 nm), thus precluding their direct imaging. Up to now, the main techniques used to assess the partition of proteins of interest inside lipid rafts were Detergent Resistant Membranes (DRMs) isolation and co-patching with antibodies. Though widely used because of their rather easy implementation, these techniques were prone to artefacts and thus criticized7,8. Technical improvements were therefore necessary to overcome these artefacts and to be able to probe lipid rafts partition in living cells.
Here we present a method for the sensitive analysis of lipid rafts partition of fluorescently-tagged proteins or lipids in the plasma membrane of living cells. This method, termed Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), relies on the disparity in diffusion times of fluorescent probes located inside or outside of lipid rafts. In fact, as evidenced in both artificial membranes and cell cultures, probes would diffuse much faster outside than inside dense lipid rafts9,10. To determine diffusion times, minute fluorescence fluctuations are measured as a function of time in a focal volume (approximately 1 femtoliter), located at the plasma membrane of cells with a confocal microscope (Fig. 1). The auto-correlation curves can then be drawn from these fluctuations and fitted with appropriate mathematical diffusion models11.
FCS can be used to determine the lipid raft partitioning of various probes, as long as they are fluorescently tagged. Fluorescent tagging can be achieved by expression of fluorescent fusion proteins or by binding of fluorescent ligands. Moreover, FCS can be used not only in artificial membranes and cell lines but also in primary cultures, as described recently12. It can also be used to follow the dynamics of lipid raft partitioning after drug addition or membrane lipid composition change12.

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

A technique to probe the lipid raft partitioning of fluorescent proteins at the plasma membrane of living cells is described. It takes advantage of the disparity in diffusion times of proteins located inside or outside of lipid rafts. Acquisition can be performed dynamically in control conditions or after drug addition.

Détermination de radeaux lipidiques partitionnement de sondes par fluorescence-marqués dans les cellules vivantes par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

La détection de l&#39;ARN viral par fluorescence<em&gt; In situ</emHybridation&gt; (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

À haut débit de cartographie physique des chromosomes à l&#39;aide automatisée<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Robuste FISH 3D DNA Utilisation des sondes directement marquées

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imagerie en temps réel de l&#39;unité d&#39;ingénierie des ARN transcrits dans des cellules vivantes utilisant Ratiométrique bimoléculaires Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

Étude de l&#39;ADN Looping par une seule molécule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Synthèse de la longueur d'onde de décalage d'ADN à l'aide de sondes d'hybridation cyanine photostable

Résumé

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Chapitres dans cette vidéo

Étiquetage sélective des protéines de surface cellulaire utilisant CyDye DIGE Fluor Colorants Minimal

Génération d'ADN / ARN hybrides d'ADN génomique par la transformation en utilisant l'ARN contenant Oligonucléotides

Cellules souches: le contrôle qualité des échantillons, hybridation Array et balayage

Détermination de radeaux lipidiques partitionnement de sondes par fluorescence-marqués dans les cellules vivantes par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)

La détection de l'ARN viral par fluorescence

À haut débit de cartographie physique des chromosomes à l'aide automatisée

Robuste FISH 3D DNA Utilisation des sondes directement marquées

Imagerie en temps réel de l'unité d'ingénierie des ARN transcrits dans des cellules vivantes utilisant Ratiométrique bimoléculaires Beacons

Étude de l'ADN Looping par une seule molécule FRET

Méthode simple pour l'ADN fluorescence