Ce protocole offre une méthode pour cartographier les forces moléculaires générées par les cellules et en particulier les cellules immunitaires. Le protocole est essentiel pour les laboratoires intéressés par l’étude de la mécanotransduction en mécanobiologie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est super facile et permet d’utiliser la microscopie à fluorescence conventionnelle pour quantifier la transmission de la force dans les cellules immortalisées et primaires.
Pour commencer, placez des lamelles de couverture de 25 millimètres sur une grille en polytétrafluoroéthylène dans un bécher de 50 millilitres et rincez les lamelles trois fois en les immergeant dans l’eau. Mélanger des volumes égaux d’éthanol et d’eau et ajouter 40 millilitres de cette solution au bécher contenant la grille et les lames de couverture. Ensuite, scellez le bécher à l’aide de ruban adhésif parafilm.
Nettoyez les lamelles de couverture en sonicant le bécher pendant 15 minutes dans un nettoyeur à ultrasons et jetez le liquide après la sonication. Ensuite, rincez le bécher contenant la grille et les lamelles de couverture avec de l’eau au moins six fois pour éliminer tout solvant organique restant. Pour préparer une solution fraîche de piranha, ajoutez 30 millilitres d’acide sulfurique à un bécher de 50 millilitres et ajoutez lentement 10 millilitres de peroxyde d’hydrogène.
Mélanger délicatement la solution de piranha à l’aide de l’extrémité d’une pipette en verre. Pour lancer la gravure, transférer la grille contenant les lamelles de couverture dans le bécher contenant la solution de piranha et incuber pendant 30 minutes à température ambiante pour nettoyer et hydroxyler les lamelles de couverture. Ensuite, transférez la grille à l’aide d’une pince à épiler en acier ou en polytétrafluoroéthylène dans un bécher propre de 50 millilitres et rincez à l’eau six fois.
Afin d’éliminer complètement l’eau, immergez la grille contenant les lamelles de couverture dans un bécher de 50 millilitres avec 40 millilitres d’éthanol. Ensuite, jetez l’éthanol. Ensuite, immergez la grille dans 40 millilitres d’éthanol contenant 3% d’aminopropyltriéthoxysilane pendant une heure à température ambiante pour initier la réaction avec le groupe hydroxyle sur les lamelles de couverture.
Rincez six fois la surface des lamelles de couverture en les immergeant dans 40 millilitres d’éthanol et séchez-les dans un four à 80 degrés Celsius pendant 20 minutes. Couvrir le fond intérieur de la boîte de Petri avec un ruban de parafilm pour empêcher les lamelles de couvercle de glisser à l’intérieur de la boîte de Pétri. Ensuite, placez les lamelles de couverture recouvertes d’amine avec le côté à fonctionnaliser avec les sondes de tension de l’ADN tournées vers le haut.
Couvrez les lamelles à 20 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Pour modifier les groupes amines sur les lames de couverture, ajouter de l’acide lipoïque PEG NHS et mPEG NHS et incuber la boîte de Petri à température ambiante pendant une heure. À la fin de l’incubation, rincez la surface trois fois avec de l’eau.
Après cela, ajoutez 100 microlitres de bicarbonate de sodium 0,1 molaire contenant un milligramme par millilitre de sulfo-NHS-acétate à un ensemble de lamelles de couverture sandwich et incuber pendant 30 minutes pour que la passivation se produise. Ajouter 0,5 millilitre de nanoparticules d’or à chaque lamelle de couverture et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Après l’incubation, rincez les lamelles de couverture avec de l’eau trois fois.
Après avoir ajouté Black Hole Quencher 2 brins à la sonde de tension d’ADN recuite dans un rapport de dix pour un, ajoutez 100 microlitres du mélange par deux lamelles de couverture pour faire le sandwich. Placez soigneusement une boule de mouchoir humide dans la boîte de Pétri, loin des lamelles de couverture, et scellez la capsule avec du ruban adhésif pour empêcher la solution de sécher. Après cela, couvrez le plat avec une feuille d’aluminium et incuberez-le à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, assemblez la chambre d’imagerie en prenant soin d’éviter les fissures de surface lors du serrage de la chambre. Ensuite, ajoutez 0,5 à un millilitre de solution saline équilibrée de Hank dans la chambre d’imagerie. Utilisez le canal Cy3B avec un objectif 100X pour capturer les signaux fluorescents des cellules plaquées sur les sondes de tension en épingle à cheveux de l’ADN lorsqu’elles commencent à se propager.
Après avoir préparé 100 microMolaires de brins de verrouillage non fluorescents, au point de temps souhaité, ajoutez-le aux cellules à une concentration finale d’un microMolaire dans la chambre d’imagerie pour stocker le signal de tension et le mélanger avec les cellules par pipetage. Après environ 10 minutes de verrouillage, acquérir des films accélérés ou des images de point final en épifluorescence pour la cartographie qualitative de la tension et l’analyse quantitative. Une surface réussie avait une couleur rose pâle.
La haute qualité de la surface a été démontrée avec un fond propre et la microscopie de contraste d’interférence de réflexion ou le canal RICM et une intensité de fluorescence uniforme dans le canal Cy3B. Les images accélérées du verrouillage de tension ont indiqué que les signaux de tension TCR anti-CD3 epsilon et TCR-peptide-MHC étaient amplifiés en raison du verrouillage en épingle à cheveux et de l’accumulation de signal. Le brin de verrouillage a enregistré des événements de traction mécanique de courte durée du peptide TCR MHCN4 à partir de zéro minute, ce qui a facilité l’analyse quantitative et révélé le modèle distinct de la force MHC du peptide TCR qui ressemblait au motif bullseye des synapses immunitaires.
Chaque étape, la préparation du substrat de votre sonde d’intention nécessite une attention aux détails et une manipulation minutieuse des matériaux. Cette technologie permet de visualiser les forces moléculaires transitoires qui se produisent à la surface de la cellule lorsqu’elle interagit avec l’environnement, en particulier dans les cellules immunitaires à la recherche d’antigènes.
