smFISH est connu pour mesurer le nombre absolu comme emplacement sous cellulaire des ARNH. Notre protocole sMFISH de deux couleurs a la capacité supplémentaire de mesurer la cinétique de la transcription et de la dégradation de l’ARNm. En utilisant cette méthode, de nombreux échantillons peuvent être traités simultanément sans plus de temps ni d’effort.
Par exemple, quatre expériences de cours de temps donnant 48 échantillons peuvent être traitées pour imagerie en huit heures. Notre protocole est largement applicable à de nombreux gènes et espèces bactériennes. Pour préparer des feuillets de couverture et des glissières en verre pour l’expérience.
Utilisez des forceps pour placer des glissements de couverture et des glissières dans un bocal Coplin contenant 100% d’éthanol et placez le bocal dans un bain d’eau ultrasonique répondre pendant 15 à 20 minutes. À la fin de la sonication laver les glissières et couvrir glisse trois à quatre fois avec de l’eau ultra pure avant de remplir le bocal avec 70% d’éthanol et de répéter la sonication. Lorsque toutes les étapes de sonication sont terminées, séchez les glissements de couverture et glissez avec du gaz azoté.
Placez le couvercle glisse dans une boîte vide de pointe de pipette de 1000 microlitres et placez les glissières dans une boîte de glissière propre. Ensuite, en suivant les trous de la boîte à pointes pipette utiliser un marqueur hydrophobe pour dessiner des cercles sur les feuillets de couverture et d’appliquer une baisse de 20 microlitres de 0,1%Poly l lysine à chacun de ces puits. Pour mettre en place une expérience de cours du temps, ajoutez 750 microlitres d’une culture E.coli de croissance exponentielle de 20 millilitres à un tube de culture de 1,5 millilitre marqué temps zéro.
Et inverser immédiatement le tube. Induire l’expression du lac Z avec 0,2 à un millimolar IPTG et démarrer une incontrème. Après avoir vérifié la timer, recueillir la culture cellulaire à chaque point de temps expérimental consécutif comme vient de le démontrer.
Au moment opportun au cours de l’expérience, ajouter cinq millimolaires ONPF à la fiole pour réprimer l’expression du lac Z et continuer à échantillonner les cultures pour suivre la dégradation de l’ARNm. À la fin de l’acquisition de l’échantillon de cours, incuber les échantillons à température ambiante pendant 15 minutes, puis les incubations sur glace pendant 30 minutes. À la fin de la centrifugeuse d’incubation, les échantillons pour enlever le fixatif et utiliser une pipette pour enlever le supernatant.
Re-suspendre les bactéries dans un millilitre de DEPC PBS et laver les cellules deux fois de plus en un millilitre de PBS DEPC frais par lavage. Après le dernier lavage, suspendre à nouveau les cellules dans 30 microlitres de PBS DEPC frais. Pour la perméabilisation des cellules.
Ajoutez d’abord l’échantillon à partir de chaque point de temps à des puits hydrophobes individuels sur l’un des feuillets de couverture en verre stérilisés à l’éthanol. Et permettre aux cellules d’adhérer à la feuille de couverture avec une incubation de 10 à 30 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, ajouter 15 microlitres de 70 % d’éthanol à chaque puits.
Après quatre minutes, aspirer l’éthanol de chaque puits afin que les puits soient complètement secs. Après lavage ajouter 30 microlitres de solution de pré-hybridation à chaque puits de cellules perméabilisées, et incuber les cellules pendant 30 minutes dans un four de 37 degrés Celsius. Remplacer la solution de pré-hybridation par environ 30 microlitres de solution d’hybridation de sonde par puits.
Et couvrir la chambre de papier d’aluminium pendant deux heures d’incubation dans le four de 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, utilisez une pipette multicanal pour rincer les puits trois à cinq fois avec 30 microlitres de solution de lavage par puits par lavage. Après le dernier lavage, incuber les cellules pendant 15 à 30 minutes à 37 degrés Celsius avant de laver les puits cinq fois avec 30 microlitres de PBS DEPC frais par lavage.
Après le dernier lavage, aspirer tout le liquide de la feuille de couverture. Et ajouter quatre microlitres de DEPC PBS frais à chaque puits. Utilisez des forceps pour placer soigneusement le glissement du couvercle sur un échantillon de glissière en verre stérilisé à l’éthanol vers le bas, et utilisez de la gomme dentaire en silicone pour sceller les bords du glissement du couvercle.
Pour localiser une zone d’intérêt, sélectionnez le mode en direct d’imagerie par contraste de phase et manœuvrez le joystick de scène pour changer le champ de vision dans un puits. Situé une zone dans laquelle la densité cellulaire est optimale et ajuster la mise au point Z de telle sorte que les images de la cellule de contraste de phase sont au point. Ensuite, acquérir une image C cinq avec une exposition de quatre secondes, une image C trois avec une exposition de deux secondes et une image de contraste de phase avec une exposition de 0,2 seconde pour environ 10 zones différentes par puits.
Alternativement, une acquisition NDI dans laquelle C cinq, C trois et phases contrastées images sont acquises en série peut être exécuté. Lorsque tous les puits ont été photographiés, ouvrez un outil de segmentation cellulaire approprié et déchez la pile. Chargez les images de contraste de phase d’intérêt et sélectionnez des images indépendantes et cliquez sur calculer le profil de phase comme zéro.
Pour commencer le processus de segmentation au cours duquel les cellules seront identifiées et leurs contours seront calculés. Chargez les paramètres fournis dans le dossier GitHub et cliquez sur tous les cadres. À la fin du traitement sélectionnez le contour pour visualiser le maillage.
Ensuite, sous l’onglet détection ponctuelle, décocher la pile, vérifier les mailles et cliquer sur frotter pour commencer l’identification des taches et la quantification basée sur les deux raccords Gaussian D. Sélectionnez le dossier contenant les images fluorescentes et le fichier de maille qui vient d’être calculé à partir de la procédure de détection cellulaire et indiquez le nom du fichier auquel les résultats de détection ponctuelle seront enregistrés. Ensuite, utilisez le workflow d’analyse d’image fourni sur GitHub pour analyser les images de fluorescence.
Dans ce champ de vision complet, environ 500 cellules E.coli à une bonne densité de segmentation cellulaire peuvent être observées. La morphologie des cellules dans les images de contraste de phase devrait rester comparable à celle des cellules vivantes à des fins de segmentation. Si les cellules sont surcommenciées, leur morphologie deviendra impropre à la segmentation.
La distribution des intensités ponctuelles de l’ARNm du lac Z avant l’induction ne correspond pas bien à une distribution normale ou poisson en raison de la présence de taches à forte intensité. Lorsque l’expression du lac Z est induite, le signal de cinq ARNm Z de lac Z augmente avant que le signal d’ARNm de trois premiers lac Z augmente. Si l’expression du lac Z est réprimée, les signaux d’ARNm de cinq et trois premiers lac Z diminuent.
Pour obtenir le taux d’allongement de transcription, la montée des cinq et trois signaux principaux sont adaptés avec les lignes. Alors que le taux de dégradation de l’ARNm est obtenu en adaptant la région de décomposition avec une fonction exponentielle. Puisque le poisson de molécule simple est une technique de cellule simple, les variabilités de cellule à cellule dans la transcription peuvent également être analysées.
De plus, l’analyse de la colocalisation de cinq ARNm Z premier et de trois principaux lac Z permet de quantifier la densité des polymésases ARN sur le gène du lac Z. Comme les échantillons de différents points de temps sont manipulés simultanément au cours de cette procédure. Il est important de garder l’échantillon séparé pendant qu’ils sont dans les tubes et sur le bordereau de couverture.
En utilisant cette technique de microscopie à cellules simples à molécule unique. Les chercheurs peuvent maintenant explorer comment la cinétique de la transcription et de la dégradation de l’ARNm est liée aux nombres absolus ou aux emplacements subcellulaires des ARNM.
