Ce protocole fournit deux méthodes pour mobiliser C.Elegans pour effectuer l’imagerie in vivo calcium des muscles de la paroi du corps. Cette méthode peut aider à répondre aux questions liées à l’homéostasie du calcium et la manipulation du calcium, et une synapse accessible dans l’organisme génétiquement rétractable. Cette technique peut fournir une meilleure compréhension des mécanismes régulant l’homéostasie du calcium musculaire, et peut, par conséquent, être important dans l’identification des conditions ou des voies moléculaires qui ont un impact sur le couplage de contraction d’excitation par la mauvaise régulation du cycle du calcium.
Ces méthodes peuvent fournir un aperçu des domaines de recherche, y compris, mais pas limité aussi, la neurobiologie, la biologie du développement et la biologie cellulaire. Ces techniques pourraient être adaptées pour étudier une variété de types de cellules et de C.elegans, d’autres nématodes connexes ainsi que des larves de filsafat. La démonstration visuelle de cette méthode est critique afin que l’expérimentateur puisse comprendre la technique de dissection, et être en mesure d’évaluer avec précision les transitoires de calcium des animaux correctement immobilisés.
Commencez par installer le microscope pour l’imagerie fluorescente. Utilisez une caméra scientifique CMOS capable d’imagerie full frame à 100 hertz afin de suivre les changements rapides des niveaux de calcium. Contrôlez l’acquisition de caméras et l’excitation fluorescente LED avec un logiciel de microbrasserie fonctionnant dans ImageJ.
Utilisez un plug-in de plate-forme électronique opensource qui se connecte à une carte de microcontrôleur opensource externe pour gérer les impulsions de synchronisation externes qui contrôlent les excitations fluorescentes. Pour contrôler la logique de synchronisation, activez le protocole d’acquisition de microbrasserie dans le logiciel selon les instructions des fabricants. Utilisez deux LED pour stimuler la rhodopsine du canal avec la lumière bleue et enregistrer les changements RCaMP.
Activez la rhodopsine de canal avec la LED d’am avec la longueur d’onde maximale d’admission de 470 nanomètres et un filtre de bandpass, et excitez RCaMP avec une LED avec une longueur d’onde maximale d’admission de 594 nanomètres et un filtre de bandpass. Co-illuminer les deux LED et transmettre la lumière à la même voie optique à l’aide d’un faisceau dichroïque combiner. Contrôler le moment de l’éclairage LED avec un interrupteur à l’état solide contrôlé par des signaux TTL selon les directions manuscrites, et définir l’intensité LED avec les alimentations électriques linéaires de bruit de charge contrôlée actuelle, puis programmer le protocole de simulation de la lumière bleue dans un simulateur.
Dans cette expérience activer la simulation de la lumière bleue après deux secondes de capture de la fluorescence RCaMP seulement et utiliser un train de cinq, deux millisecondes impulsions de lumière bleue avec des intervalles de 50 millisecondes pour activer la rhodopsine canal. Si vous utilisez la préparation de dissection, effectuez la dissection de C.elegans en basse lumière. Placez les animaux dans le plat de dissection avec la base de coverslip recouverte de silicone qui est remplie d’un millimole de solution extracellulaire de calcium préparé selon les directives manuscrites.
Collez les animaux à l’aide de l’adhésif liquide topique de la peau avec coloration bleue le long du côté dorsale du ver. Et faire une incision cuticule latérale le long de l’interface colle et ver à l’aide d’aiguilles en verre. Utilisez une pipette buccale pour dégager les viscères internes de la cavité du ver, puis collez le rabat cuticule de l’animal pour exposer les muscles ventrals médiaux de la paroi corporelle pour l’imagerie.
Si vous utilisez la préparation nano-perle, faire une solution fondue 5%Agra en utilisant de l’eau distillée à un volume final de 100 millilitres. Utilisez une pipette Pasteur pour placer une goutte de solution en fusion-Agra sur une glissière en verre et placez immédiatement une deuxième glissière de verre sur le dessus en utilisant une pression douce pour créer un pad agra même. Retirer la lame supérieure et à environ quatre microlitres de nanobilles de polystyrène au milieu de la garniture.
En basse lumière ajouter quatre à six C.elegans dans la solution nano-perles, en s’assurant que les animaux ne sont pas allongés les uns sur les autres, et placer soigneusement un coverslip sur le dessus. Lorsque vous êtes prêt à l’image, placez la diapositive préparée ou le plat de dissection sur le microscope et de trouver et de se concentrer sur un ver en utilisant 10 fois grossissement et faible éclairage du champ lumineux. Passez à 60 fois le grossissement dans l’excitation fluorescente RCaMP pour identifier un muscle médial ventrum mur du corps qui est antérieur à la vulve et dans le plan vocal correct.
Ensuite, changez la voie d’image de l’oculaire à la caméra en tirant le basculement et en cliquant en direct dans le logiciel d’acquisition de données. Cliquez sur le bouton ORI dans le logiciel d’acquisition de données, et créez une boîte autour du muscle sur qui se concentre. Sur le stimulateur, allumez la voie de stimulation de la lumière bleue précédemment programmée, puis cliquez sur Acquérir sur le logiciel d’imagerie pour capturer l’image.
Lorsque les C.elegans sont cultivés sur la rétine tout-trans, incorporant avec succès la rétine et activant la rhodopsine de canal, un transitoire de calcium peut être évoqué. Si les animaux ne sont pas exposés à la rétine tout-trans, aucun calcium musculaire transitoire n’est déclenché. Ce protocole a été utilisé pour étudier la perte de la fonction sca-1 mutants, qui ont un impact sur la pompe à calcium réticulum sarcoplasmique codé par le gène sca-1.
Mais, les augmentations de préparation de dissection des niveaux de ligne de base de fluorescence de RCaMP ont été observées dans le mutant comparé au contrôle, suggérant que la mutation a besoin des niveaux élevés de calcium cytoplasmique de repos. Il y avait une diminution significative des niveaux de calcium de pointe dans les mutants de sca-1 par rapport au contrôle. Cependant, aucun changement n’a été observé dans l’heure de pointe augmentée ou la mi-temps de décomposition.
Fait important, des résultats similaires peuvent être observés en utilisant la préparation de nano-perles moins difficile sur le plan technique. La perte de la fonction slo-mutants, qui perturbent le calcium activé de grands canaux de potassium ont été évalués afin d’étudier les mutants qui ont indirectement un impact sur la manipulation du calcium chez C.elegans. Lorsque les niveaux de base du RCaMP ont été mesurés, les mutants ont affiché une fluorescence accrue par rapport aux témoins.
Lors de l’évaluation de la cinétique du calcium transitoire aucun changement dans les niveaux de calcium de pointe n’a été vu. Les mutants slo-1 (par exemple142) ont toutefois montré une augmentation significative à l’heure de pointe. L’étape la plus importante à retenir lors de l’achèvement de la procédure est de préparer des animaux expérimentaux dans la rétine tout-trans.
Sans cette étape, la rhodopsine du canal sera inactive, empêchant les transitoires de calcium induits par la lumière d’être déclenchés. Après cette procédure, l’électrophysiologie et l’analyse comportementale peuvent être faites pour évaluer l’impact fonctionnel de tout changement observé dans l’homéostasie du calcium. En utilisant les méthodes d’immobilisation décrites ici, ouvre la voie à une exploration plus approfondie de la dynamique du calcium et démontre que des résultats comparables peuvent être observés en réponse à la stimulation neuronale optogénétique et la capture des transitoires de calcium musculaire en utilisant la technique beaucoup moins difficile d’immobilisation des perles.
