L’analyse de ligature de proximité in situ ou PLA, est une technologie capable de détecter les interactions entre les protéines, les tissus apposés et les cellules. Les associations entre les protéines peuvent être identifiées et quantifiées sans avoir besoin d’expression transgénique ou de techniciens supplémentaires. La seule exigence est la disponibilité d’anticorps spécifiques à haut rendement qui peuvent être modifiés avec des oligonucléotides d’ADN.
Dans les tissus MST1 et MST2 existent principalement en tant qu’homodimers actifs, mais les stimuli oncogènes peuvent augmenter le niveau d’heterodimers MST1 MST2 et ces heterodimers sont inactifs. Après incubation avec des anticorps d’amorce spécifiques contre les protéines d’intérêt, des anticorps secondaires spécifiques spéciaux, chacun lié à un brin d’ADN unique, court et complémentaire qui lui est attaché, sont ajoutés à la fente pour se lier aux anticorps primaires. Si les protéines en question sont heterodimérisées, les anticorps primaires et les anticorps secondaires qui y sont liés seront à proximité.
Dans cet état, les brins attachés d’ADN sur les deuxièmes anticorps peuvent interagir par un ajout ultérieur de deux autres oligonucléotides d’ADN de cercle-formation. Plusieurs centaines de réplications du cercle d’ADN peuvent se produire après une réaction d’amplification et un signal de fluorescence est généré par des sondes oligonucléotides complémentaires nivelées. Par conséquent, chaque signal détecté est visualisé comme un point fluorescent individuel qui peut être attribué à un endroit subcellulaire spécifique basé sur des images au microscope.
La veille de l’expérience, enduire 16 diapositives bien chambées en ajoutant 50 à 100 microlitres de laminine de souris ou de poly-L-lysine et incuber à 37 degrés Celsius. Après 30 minutes, enlever la solution froide, diviser les cellules à l’aide de trypsine et plaquer 15 000 à 25 000 cellules par puits en 16 lame bien chambées. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié de dioxyde de carbone de 5% pendant 24 heures.
Après 24 heures, retirer le milieu des puits et laver délicatement les cellules avec du PBS. Utilisez une micropipette pour minimiser la prise de risque de l’échantillon, puis aspirez le PBS et fixez les cellules en ajoutant 50 microlitres de 4%PFA par puits et incubez pendant 10 minutes à température ambiante sans agitation. Ne pipette pas la solution directement sur les cellules, car cela peut entraîner un décollement des cellules.
Après la fixation, laver les cellules avec TBST trois fois pendant cinq minutes chacune avec une légère agitation. Perméabiliz ensuite les cellules et incubez pendant 10 minutes à température ambiante sans agitation. Une fois la perméabilisation terminée, lavez les cellules avec tbst trois fois pendant cinq minutes par lavage avec agitation.
Après avoir enlevé tbst ajouter une goutte de solution de blocage dans chaque puits et incuber les diapositives dans une chambre d’humidité préchauffée pendant une heure à 37 degrés Celsius. Diluer les anticorps primaires. Retirez la solution de blocage à l’aide d’une micropipette, mais ne laissez pas sécher les glissières.
Vortex et ajouter 40 microlitres de la solution d’anticorps dilué aux puits appropriés et incuber les échantillons à 37 degrés Celsius dans une chambre d’humidité préchauffée pendant une heure. Pendant l’incubation, diluer les deux sondes PLA dans le diluant anticorps. Pour chaque échantillon préparer 40 microlitres de sonde PLA.
Après une heure d’incubation, aspirer la solution d’anticorps et laver les toboggans deux fois pendant cinq minutes avec tbst à température ambiante. Retirez doucement le TBST des glissières et ajoutez 40 microlitres de la solution de sonde PLA à chaque puits. Incuber les glissières dans une chambre d’humidité préchauffée pendant une heure à 37 degrés Celsius.
Vortex et diluer les volumes requis du stock de ligature 1 à 5 dans de l’eau de haute pureté immédiatement avant l’utilisation. 40 microlitres de la solution de ligature sont nécessaires pour chaque puits. Après l’incubation, retirer la solution PLA des glissières et les laver deux fois dans tbst pendant cinq minutes à température ambiante avec agitation.
Utilisez un bloc de congélation lors de l’élimination des ligases du congélateur et juste avant de l’ajouter aux cellules, vortex et diluer avec la solution de ligature. Retirez le TBST des toboggans et ajoutez 40 microlitres de la solution ligase de ligature à chaque puits. L’incubation glisse dans une chambre d’humidité préchauffée pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.
Après l’incubation aspirer la solution et laver deux fois avec TBST pendant cinq minutes à température ambiante avec agitation. Évitez d’exposer le puits à la lumière vive car les reagents sont sensibles à la lumière. Lors du dernier lavage, vortex et diluer les volumes d’exigence de solution d’amplification dans de l’eau de haute pureté immédiatement avant l’utilisation.
Gardez la polymése sur la glace ou dans un bloc de refroidissement et juste avant de l’ajouter au vortex des cellules et diluer avec la solution d’amplification. Aspirez le TBST des puits et ajoutez 40 microlitres de solution d’amplification à chaque puits. Incuber glisse dans une chambre d’humidité préchauffée foncée pendant 100 minutes à 37 degrés Celsius.
Après l’incubation, aspirer la solution de polymésase d’amplification à partir des glissières et laver deux fois dix minutes chacun dans TBST à température ambiante. Retirez complètement les chambres et le silicone autour des puits de la lame. Racler le reste des perles de silicone avec un rasoir.
Dessinez une grille sur la glissière séparant chaque puits. Ajouter environ 40 microlitres du milieu de montage avec DAPI, en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne soit prise sous le bordereau de couverture. Utilisez du vernis à ongles pour fixer le verre de couverture.
L’analyse microscopique peut être effectuée en 20 minutes après la fixation, mais dans la pratique, nous trouvons plus pratique d’effectuer l’analyse d’image le lendemain. Pour analyser les échantillons, nous utilisons un microscope à balayage laser leica SP8. Montré ici sont des exemples d’analyse de ligature de proximité in situ visualisant la proximité entre les protéines MST 1 et MST2 dans les cellules rénales embryonnaires humaines dans les panneaux A à D, et les cellules humaines Schwann dans les panneaux E à H.In tous les noyaux cellulaires panneaux sont tachés bleu par DAPI et les points rouges indiquent des signaux de ligature de proximité positive résultant de la proximité entre les protéines indiquées.
Le panneau A montre la proximité de MST1 et MST2 et le panneau B montre la proximité d’ERK et de phosphoERK car ces épitopes sont sur la même protéine. Le panneau C représente un contrôle négatif car ces cellules comme MST1 et MST2 et le panneau D représentent un deuxième contrôle négatif taché d’anticorps pour MST1 et ERK qui ne devraient pas être à proximité les uns des autres. Les panneaux E et F montrent la proximité de MST1 avec MST2 et ERK avec phosphoERK dans les cellules de Schwann.
Les panneaux G et H ne sont des témoins négatifs tachés qu’avec des anticorps MST1 ou avec des anticorps MST1 et ERK. Il est impératif d’utiliser des anticorps primaires non réactifs qu’il ne devrait reconnaître qu’un seul membre de l’heterodimer. En outre, il est important de se rappeler d’utiliser différents conseils pour éviter la contamination croisée des anticorps primaires et des sondes PLA, pour éviter de toucher le fond du puits, et pour éviter le pipetting directement sur les échantillons.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser pla in situ pour étudier la dimérisation des protéines dans les cellules fixes.
