Nous remercions le Bloomington Drosophila Stock Center pour fournir des stocks de mouches. Nous remercions également le Hybridoma Banque études développementales et le Dr Lynn Cooley (Université de Yale) pour fournir des anticorps. Un merci spécial à AhHyun Yoo pour son aide sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions du Fonds acier Isabelle Ada (Krieger) Conseil de recherches en génie du Canada (Krieger) les sciences naturelles et le William et et les Instituts canadiens de recherche en santé (Harden).

1. Préparation du corps mur REMARQUE: Préparation du troisième stade larvaire parois du corps (par étude des NMJs qui innervent les muscles de la paroi du corps) a été réalisée comme décrit précédemment dans Brent et al dix, ou Ramachandran et Budnik 11,12, mais avec quelques modifications.. <ol><li> Dissection <ol><li> Augmenter les stocks et les croix mouche à 25 ° C pendant cinq à six jours en utilisant des procédures standard 13. </li><li> Choisissez ramper troisième stade larvaire de flacons ou bouteilles en utilisant une pince fine. </li><li> Laver les larves dans une petite boîte de Pétri contenant un tampon phosphate salin (PBS) pour éliminer les particules alimentaires. </li><li> Placez une seule larve sur un disque de Sylgard et la plonger dans quelques gouttes de PBS glacé. Utilisation de PBS glacé aidera étourdir la larve qui rend plus facile à manipuler. Tout au long de la dissection, veiller à ce que la préparation est toujours immergé dans du PBS pour l&#39;empêcher de sécher. </li><li> Placez le larva avec sa face dorsale orientée vers le haut de sorte que les deux secteurs de la trachée sont visibles sous un microscope à dissection (figure 2A). En utilisant les forceps pour saisir une broche de minuties, épingler la larve vers le bas à l&#39;extrémité postérieure près des stigmates (figure 2B). Avec une autre épingle, percer à travers la cuticule à l&#39;extrémité antérieure près de l&#39;embouchure crochets. Étirer doucement la larve sur la longueur, puis épingler le bas (figure 2B). </li><li> Avec des ciseaux de microdissection, pincez l&#39;extrémité postérieure près de la broche pour créer une petite ouverture. L&#39;incision doit être assez superficielle juste passer à travers la cuticule. </li><li> Mise en place de la pointe de la lame inférieure des ciseaux dans l&#39;incision, coupé le long de toute la longueur de la ligne médiane dorsale entre les deux voies trachéaux (figure 2C). Dirigez les lames de ciseaux légèrement vers le haut lors de la coupe pour éviter d&#39;endommager les muscles de la paroi ventrale du corps. </li><li> Faire une petite incision horizontale légèrement antérieur au posteeriorly broche placée (figure 2C). Faire une autre incision similaire légèrement postérieure à la broche antérieurement placé (figure 2C). Les incisions doivent simplement passer à travers la cuticule. NOTE: Les trois incisions des étapes 1.1.7 et 1.1.8 combinés devrait ressembler à un &quot; <img fo:content-width="0.09in" src="/files/ftp_upload/52139/52139_letter_I.jpg" width="15px" /> &quot;Une fois terminé, ce est à dire, un volet de gauche et de droite sur la face dorsale du corps de la larve devrait être produite. </li><li> Nettoyer soigneusement les organes internes avec la pince. Ajout de quelques gouttes de PBS énergiques aidera déplacer les organes du corps larvaire, rendant ainsi plus facile de les enlever. Évitez piquer le corps des larves car il risque d&#39;endommager les muscles de la paroi du corps. </li><li> Déroulez le corps des larves ouverte et épinglez les coins vers le bas (Figure 2D). Lorsque l&#39;épinglage, étirer la paroi du corps à la fois horizontalement et verticalement pour former un rectangle uniformément tendu (soie Figure 2G pour la forme), en prenant soin de ne pas déchirer les muscles de la paroi du corps dans le processus. </li><li> Terminer la suppression de tous les organes internes restants (figure 2E). </li></ol></li><li> Fixation et perméabilisation <ol><li> Plonger les parois du corps épinglés dans plusieurs gouttes de solution de Bouin. Incuber pendant 15 min sur la glace. Vous pouvez également utiliser paraformaldéhyde 4% (PFA) comme un autre fixateur; incuber pendant 30 min. </li><li> Rincer trois fois avec du tampon phosphate salin avec du Triton (PBT). </li><li> En utilisant des pinces fines, retirez soigneusement les broches et transférer les parois du corps par leurs coins en 0,65 ml microtube siliconé. </li><li> Conserver les parois du corps dans PBT à 4 ° C jusqu&#39;au moment de PLA. Pour des résultats optimaux, commencer immunocoloration les parois de la caisse dans un jour ou deux de dissection. REMARQUE: Pour enregistrer sur les réactifs et d&#39;assurer que tous les murs du corps sont traités de manière égale pendant l&#39;essai, différents génotypes peuvent être placés dans un seultube. Les génotypes peuvent être distingués en coupant les coins des parois de la caisse différemment (voir la figure 2F pour des exemples). </li></ol></li></ol> 2. immunohistochimie REMARQUE: Immunomarquage de troisième stade larvaire parois du corps a été effectuée comme décrit précédemment dans Brent et al 14 et Ramachandran et Budnik 11, mais avec quelques modifications 11,14.. REMARQUE: Effectuez toutes les étapes à la température ambiante et sous agitation douce, sauf indication contraire. <ol><li> Blocage <ol><li> Laver les parois du corps avec PBT trois fois pendant 10 minutes chacun. </li><li> Bloquer avec 1% de sérum-albumine bovine (BSA) pendant 1 heure. </li></ol></li><li> Immunocoloration <ol><li> Incuber les parois de la caisse avec la souris et le lapin primaires d&#39;anticorps contre les deux protéines d&#39;intérêt (dilué dans 1% de BSA) pendant 2 h à température ambiante, ou pendant une nuit à 4 ° C. Dans ce cas, utilisez 01:10 souris anti-Dlg et 1: 250 de lapin d&#39;unenti-HtsM 15,16. Les anticorps dirigés contre des marqueurs qui ne sont pas faites chez la souris ou le lapin peuvent également être inclus - par exemple, utiliser 1: 200 de chèvre anti-HRP pour délimiter les membranes neuronales. </li><li> Laver avec PBT trois fois pendant 10 minutes chacun. </li><li> Incuber avec des anticorps secondaires conjugués à un fluorophore à détecter les marqueurs (dilué dans 1% de BSA) pendant 2 h à température ambiante, ou pendant une nuit à 4 ° C. Comme le signal PLA est ensuite visualisée avec un fluorochrome rouge, un autre fluorophore doit être utilisé pour détecter le marqueur - par exemple, en utilisant 1: 200 anti-chèvre conjugué à FITC pour détecter l&#39;anticorps anti-HRP de chèvre. En raison de l&#39;utilisation de réactifs sensibles à la lumière, garder les tubes dans l&#39;obscurité partir de ce point. REMARQUE: Le kit qui est utilisée permet de PLA à effectuer entre anticorps primaires soulevées dans la souris et le lapin, avec le signal visualisé sur le canal rouge sous microscopie confocale. Si on le souhaite, d&#39;autres kits sont disponibles qui permettent à l&#39;essai à effectuer avec primaanticorps ry soulevées dans d&#39;autres espèces, et le signal visualisées sur d&#39;autres canaux. </li></ol></li></ol> 3. Proximité ligature Assay REMARQUE: Effectuez toutes les étapes à la température ambiante et sous agitation douce, sauf indication contraire. <ol><li> PLA Sondes <ol><li> Laver les parois du corps avec PBT trois fois pendant 10 minutes chacun. </li><li> Incuber avec des sondes PLA (1: 5 de chaque dilution dans 1% de BSA) pendant 2 h à 37 ° C. Dans ce cas, utiliser 40 pi de sonde PLA MOINS anti-souris, 40 pl de sonde PLA anti-lapin PLUS et 120 pi de 1% de BSA pour assurer l&#39;immersion correcte et le mélange de 5-10 parois du corps. Jusqu&#39;à une dilution 1:25 des sondes PLA peut encore se traduire par un rapport adéquat signal-sur-bruit (par exemple, pour cette expérience). </li></ol></li><li> Ligature <ol><li> Laver les parois du corps avec le tampon de lavage A deux fois pendant 5 min chacune. </li><li> Incuber avec une solution de ligature (1h40 de dilution de ligase dans un tampon de ligature) pendant 1 heure unt 37 ° C. Dans ce cas, utiliser 5 ul de ligase, 40 pi de tampon de ligature et 5 155 pi d&#39;eau de haute pureté pour assurer l&#39;immersion approprié et le mélange de 5 à 10 parois de la caisse. </li></ol></li><li> Amplification <ol><li> Laver les parois du corps avec le tampon de lavage A deux fois pour 2 minutes chacun. </li><li> Incuber avec une solution d&#39;amplification (1:80 de dilution dans du tampon de polymerase amplification) pendant 2 heures à 37 ° C. Dans ce cas, utiliser 2,5 pi de la polymérase, 40 pi de tampon 5 Amplification et 157,5 pi d&#39;eau de haute pureté pour assurer l&#39;immersion correcte et le mélange de 5-10 parois du corps. </li></ol></li><li> Préparation for Imaging <ol><li> Laver les parois du corps avec le tampon de lavage B deux fois pour 10 minutes chacun. </li><li> Laver avec 0,01x tampon de lavage B une fois pour 1 min. </li><li> Équilibrer dans quelques gouttes de solution de montage pour au moins 30 min avant le montage ou la conserver pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> En utilisant des pinces fines, transférer soigneusement les parois du corps sur une lame de la plateforme wvec leurs cuticules vers le bas. Positionner les parois de la caisse dans des rangées et dans la même orientation à l&#39;intérieur d&#39;une ou deux gouttes de milieu de montage. Placez un 22 mm x 40 mm lamelle sur la préparation en prenant soin de ne pas générer des bulles d&#39;air, puis sceller la lame avec vernis à ongles transparent. </li><li> Conserver les diapositives dans l&#39;obscurité à -20 ° C jusqu&#39;au moment de l&#39;imagerie confocale. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Ce rapport montre comment PLA peut être appliqué à la drosophile larves NMJ. Le dosage est réalisé sur des larves préparations de muscle de la paroi du corps dans le but de détecter les interactions protéine-protéine endogènes présentes à la jonction neuromusculaire. Avec cette technique, Dlg Hts et sont indiqués pour être à proximité immédiate de l&#39;autre, et ainsi exister dans un complexe, en particulier dans la région post-synaptique 27. À l&#39;appui de ce résultat, une ét...

Drosophila disques large (DLG) est un élément conservé de la famille guanylate kinase associée à la membrane d&#39;un échafaudage de protéines qui aident à orchestrer l&#39;ensemble de grands complexes de protéines à des sites spécifiques de la membrane plasmique. Initialement identifié comme une protéine suppresseur de tumeur, Dlg sert un déterminant important de l&#39;épithélium 1,2,3 apicobasal de polarité. Dlg sert également un module d&#39;échafaudage majeur à la jonction neuromusculaire (JNM) des neurones moteurs glutamatergiques cours du développement larvaire 4. Dlg joue divers rôles à la JNM des larves, et son pléiotropisme repose sur sa capacité à associer à de multiples protéines 5,6. Une telle protéine est Hu-li tai shao (Hts), un homologue aux adducins mammifères qui ont été décrites principalement en ce qui concerne leurs rôles dans la régulation du cytosquelette d&#39;actine-spectrine 7. Il a été montré précédemment que la DLG et Hts peuvent former un complexe avec l&#39;autre sur la base in vitro </em&gt; expériences de co-immunoprécipitation impliquant toute mouche adulte lysats 8. Un inconvénient de ces résultats, cependant, ce est qu&#39;ils ne indiquent pas où cela formes complexes. Avec l&#39;utilisation de l&#39;immunohistochimie, les distributions de la DLG et sont observés Hts à se chevaucher sur la membrane post-synaptique de la JNM des larves, mais elles sont dans un complexe dans cette région 8? Comme l&#39;a récemment illustré et détaillé plus loin ici, Proximité ligature Assay (PLA) est utilisé pour rechercher une association entre Dlg situ et Hts en particulier au stade larvaire NMJ 27. PLA est une technique relativement nouvelle utilisée principalement dans la culture de cellules et de tissus qui permet de détecter les interactions protéine-protéine in situ neuf. Dans ce dosage, les anticorps primaires contre les deux protéines d&#39;intérêt sont détectés avec une paire d&#39;anticorps secondaire spécifique à l&#39;espèce, appelées sondes PLA, qui sont conjugués à des oligonucleotides (Figure 1A, B). Si les deux protéiness sont à proximité étroite les uns des autres (ce est à dire au bout de quelques dizaines de nanomètres), la distance entre les sondes attachées PLA peut être comblé par l&#39;hybridation de deux oligonucléotides connecteurs complémentaires (figure 1C). Dans cette conformation, les extrémités libres des oligonucléotides connecteurs sont suffisamment proches pour entrer en contact avec l&#39;autre, et une molécule d&#39;ADN circulaire fermé peuvent être formées sur la ligature en situ (Figure 1D). La molécule d&#39;ADN circulaire sert de matrice in situ pour l&#39;amplification par cercle roulant, qui est amorcée par l&#39;un des oligonucléotides conjugués à des sondes de l&#39;APL (Figure 1E). Les séquences au sein de la amplifiée, un produit d&#39;ADN concatémère résultant peuvent ensuite être visualisées, avec des sondes oligonucléotidiques complémentaires marquées par fluorescence (Figure 1F). Étant donné que l&#39;ADN amplifié reste attaché à l&#39;une des sondes de l&#39;APL, la localisation subcellulaire de la protéine-protéine interaction withitissus na peut être facilement établi. Plusieurs méthodes sont couramment utilisées pour détecter les interactions protéine-protéine, y compris des techniques in vitro telles que la co-immunoprécipitation, pull-down des essais et de la levure Double hybride, et dans les techniques in vivo telles que le transfert Förster Resonance Energy (FRET) et bimoléculaire complémentation de fluorescence ( BiFC). Un écueil des techniques in vitro, ce est qu&#39;ils ne identifient pas où l&#39;interaction est endogène produit, tandis que les techniques in vivo l&#39;susmentionnés impliquent dans l&#39;expression artificielle de protéines de fusion qui peuvent ne pas refléter le comportement natif de leurs homologues endogènes. Un avantage majeur de PLA est qu&#39;il est capable de déterminer au sein d&#39;un tissu de la localisation subcellulaire des interacteurs protéiques endogènes qui sont à proximité étroite les uns aux autres et susceptibles formant un complexe, avec le degré de proximité nécessaire pour produire un signal comparable à FRET et BiFC. PLA peut détecter des interactions avec une spécificité élevée et une sensibilité due au couplage de la reconnaissance d&#39;anticorps et l&#39;amplification d&#39;ADN. Ainsi, le dosage peut générer des signaux lumineux discrets, sous la forme de points lacrymaux qui révèlent la position exacte de l&#39;interaction. En outre, les antigènes à peine visibles peuvent être détectés. Enfin, le PLA est une technique relativement simple à réaliser, et il ne prend pas plus d&#39;une procédure standard pour compléter immunohistochimique. Par conséquent, PLA offre un avantage technique sur d&#39;autres tests d&#39;interaction protéine-protéine qui sont souvent en proie à des temps de préparation long et vaste dépannage. Ce protocole montre comment PLA peut être appliquée à la Drosophile larvaire JNM dans le but de détecter les interactions protéine-protéine endogènes in situ. Ici, le PLA est effectuée sur des larves préparations de muscle de la paroi du corps où Dlg et Hts sont présentées d&#39;exister en effet dans un complexe dans la région post-synaptique du NMJs. PLA n&#39;a pas déjà été utilisé pour étudier la JNM des larves, et il ya à l&#39;heure actuelle seule une poignée d&#39;articles publiés qui ont utilisé cette technique dans le tissu drosophile. Il est à espérer que la poursuite de l&#39;exposition de PLA à la communauté Drosophila entraînera dans son utilisation accrue comme un outil supplémentaire pour compléter d&#39;autres, les plus couramment utilisés essais d&#39;interaction protéine-protéine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="630">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:211px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:120px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:191px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:211px;">Forceps (fine #5)</td>
			<td style="width:120px;">Almedic</td>
			<td>A10-704</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:211px;">Sylgard Disc</td>
			<td style="width:120px;">World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td style="width:191px;">Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60x15mm petri dish lid when dissecting.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter)</td>
			<td style="width:120px;">Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">Microdissection Scissors (ultra fine)</td>
			<td style="width:120px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:111px;">15200-00</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">Platform Slides</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Glue two 22x22mm coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a &#60;20mm gap in between for sample mounting.</td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">w1118</td>
			<td style="width:120px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:111px;">3605</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">hts01103</td>
			<td style="width:120px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:111px;">10989</td>
			<td style="width:191px;">Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal.</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Bouin&#39;s Solution</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">HT10132</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="114">
			<td height="114" style="height:114px;width:211px;">4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">PFA (Anachemia Science - 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">BSA (Bioshop Canada - ALB001). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">mouse anti-Dlg (Discs large)</td>
			<td style="width:120px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>4F3</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:10 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">rabbit anti-Pak (p21-activated kinase)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">mouse anti-Wg (Wingless)</td>
			<td style="width:120px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:111px;">4D4</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:5 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase)</td>
			<td style="width:120px;">Jackson&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ImmunoResearch</td>
			<td style="width:111px;">123-065-021</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">FITC-conjugated donkey anti-goat</td>
			<td style="width:120px;">Jackson&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ImmunoResearch</td>
			<td style="width:111px;">705-095-003</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO92004</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO92002</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ Detection Reagents Red</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92008</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">1x Wash Buffer A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">1x Wash Buffer B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">0.01x Wash Buffer B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82040</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of in situ protein-protein complexes at the drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Dans de type sauvage troisième stade larvaire NMJs, Dlg est principalement trouvé à la membrane postsynaptique de type I boutons glutamatergiques, avec des niveaux d&#39;immunoréactivité Dlg étant plus marquée dans le type Ib boutons que le type est boutons (figure 3A) 4. Hts est présent tout au long du muscle, mais se concentre dans la région post-synaptique avec Hts niveaux d&#39;immunoréactivité apparaissant égale dans les deux boutons de type I, et se retrouve également prés...

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Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Ce protocole montre comment Proximité Ligation Assay peut être utilisé pour détecter des interactions protéine-protéine in situ à la jonction des larves de Drosophila neuromusculaire. Avec cette technique, disques grande et Hu-li shao de tai sont présentés pour former un complexe dans la région post-synaptique, une association préalablement identifiés par co-immunoprécipitation.

Détection de<em&gt; In Situ</em&gt; complexes protéine-protéine à la<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvaire jonction neuromusculaire Utilisation Proximité ligature Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

detection-situ-protein-protein-complexes-at-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

13.0K vues.  Simon Fraser University.  Ce protocole montre comment Proximité Ligation Assay peut être utilisé pour détecter des interactions protéine-protéine in situ à la jonction des larves de Drosophila neuromusculaire. Avec cette technique, disques grande et Hu-li shao de tai sont présentés pour former un complexe dans la région post-synaptique, une association préalablement identifiés par co-immunoprécipitation. 

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Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

Visualisation des larves nerfs segmentaires en 3 Rd Instar Drosophile Les préparatifs des larves

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Recherche

Neurosciences

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

Visualisation in vivo des vésicules synaptiques Dans Drosophila larves axones segmentaire

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Dissection et l&#39;imagerie de zones actives dans le Drosophile Jonction neuromusculaire

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Séquentielle photo-blanchiment sur le tracé de cellules de Schwann simple à la jonction neuromusculaire

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Pourquoi Quantification Matters: Caractérisation des phénotypes au<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvaire jonction neuromusculaire

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Mesurer la fonctionnalité jonction neuromusculaire

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

Deux algorithmes pour Quantification haut débit et multi-paramétrique de<em&gt; drosophile</em&gt; Junction neuromusculaires Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Focal Macropatch enregistrements de courants synaptiques de la jonction neuromusculaire larves de drosophile

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

Dissection et immunohistochimie de la jambe adulte de la drosophile pour détecter les changements à la jonction neuromusculaire d’un motoneurone identifié

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting the expression of G protein-coupled receptors (GPCRs). Formalin-fixed jugular-nodose ganglia were processed with the RNAscope technology to simultaneously detect the expression of two representative GPCRs (cholecystokinin and ghrelin receptors) in combination with one marker gene of either nodose (paired-like homeobox 2b, Phox2b) or jugular afferent neurons (PR domain zinc finger protein 12, Prdm12). Labeled ganglia were imaged using confocal microscopy to determine the distribution and expression patterns of the aforementioned transcripts. Briefly, Phox2b afferent neurons were found to abundantly express the cholecystokinin receptor (Cck1r) but not the ghrelin receptor (Ghsr). A small subset of Prdm12 afferent neurons was also found to express Ghsr and/or Cck1r. Potential technical caveats in the design, processing, and interpretation of multiplex ISH are discussed. The approach described in this article may help scientists in generating accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Multiplex in situ hybridization (ISH) was employed to simultaneously visualize the transcripts for two G protein-coupled receptors and one transcription factor in the entire vagal ganglionic complex of the adult mouse. This protocol could be used to generate accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Détection de l’expression des récepteurs couplés aux protéines G dans les neurones afférents vagals de souris à l’aide de l’hybridation in situ multiplex

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...