Cette recherche est financée par les MRC et les subventions du BBSRC. Nous remercions Agata Zieba et Katerina Pardalis au Laboratoire Ulf Landegren de l&#39;Université d&#39;Uppsala pour aider à la mise en place de la technique et des conseils utiles. Biosience OLINK de l&#39;aide technique et de la présentation.

1. Placage de cellules et de traitement avec BMP <ol><li> Culture des cellules Neuro2a au GMEM supplémenté avec 10% de FBS, 1x non-acides aminés essentiels (NEAM), 1x pyruvate de sodium et 1x L-glutamine. Fractionner les cellules en utilisant la trypsine (0,05%-EDTA) et la plaque de 15.000 à 20.000 cellules par puits dans une diapositive de chambre de 16 puits. Culture HEK293T ou Cos7 cellules dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 1x L-glutamine et 1x pénicilline / streptomycine. Stériliser diapositives polysine en les plongeant dans de l&#39;éthanol 70% et en utilisant un stylo Immedge tirage de 1 cm 2 puits. Fractionner les cellules en utilisant la trypsine (0,05%-EDTA) et la plaque de 20.000 à 25.000 cellules par puits dans 50 pl de milieu. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur humidifié, 5% de CO 2 incubateur. </li><li> Après 24 h de remplacer le milieu avec sérum gratuitement GMEM (supplémenté avec 0,1% d&#39;albumine, 1x NEAM, 1x pyruvate de sodium et 1x L-glutamine) pour Neuro2a ou avec du sérum sans DMEM (complétée par la L-Glutamine et 1x pénicilline / streptomycine) pour HEK293T / Cos7 et incuber les cellules pendant 2-3 h. Gardez trois puits avec des cellules en culture dans des conditions normales (c&#39;est à dire 10% de FBS) à utiliser comme contrôles. </li><li> Traiter les cellules avec dorsomorphin (inhibiteur de la voie BMP, 2 uM) ou BMP4 (25 ng / ml) pendant le temps désiré (par exemple pendant 10 min-1 h) 5. </li></ol> 2. Fixation et perméabilisation <ol><li> Préparer le fixateur, 4% de PFA. Peser 4 g de PFA pour préparer une solution à 4% dans 100 ml de PBS. Chauffez la solution à 50 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;elle soit claire. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 um et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. Utilisez fixateur frais (non stockés pendant plus de 2 jours). </li><li> Aspirer le milieu à partir des puits et laver avec 1xPBS. Ne pas pipeter des solutions directement sur les cellules car cela peut entraîner le détachement des cellules. Avant d&#39;aller à l&#39;étape suivante, si les lames de chambre sont utilisés enlever les chambres, mais laissez le silicone autour des puits. </li><li> Ajouter 50 ul PFA 4% et incuber pendant 10min, à température ambiante, sans agitation. </li><li> Laver les cellules avec du PBS pour 3 x 5 min dans une jarre de Coplin avec agitation à température ambiante. </li><li> Traiter les cellules avec 0,5% de Triton X-100 dans du PBS pendant 10 min sans agitation à température ambiante. </li><li> Laver les cellules avec 0,05% de Tween 20 dans du TBS (TBS-T) pour 3 x 5 min dans une jarre de Coplin avec agitation à température ambiante. </li></ol> 3. Bloquant <ol><li> Secouez le TBS-T. Ajouter une goutte de solution de blocage DuoLink II (1x) par puits. </li><li> Incuber les lames dans une chambre humide préchauffée pendant 1 h à 37 ° C. </li></ol> 4. Anticorps primaires <ol><li> Mélanger et diluer aP-Smad1/5/8 (polyclonal de lapin) à 1:100 et un-Smad4 (monoclonal de souris) à 1:100 dans la DuoLink Anticorps II Diluant (1x). Préparer également aP-Smad1/5/8 et un-Smad4 seul à la même concentration pour être utilisé pour les contrôles. </li><li> Secouez la solution de blocage de la glisse. Retirez que solution beaucoup bloquant que possible, mais prenez soin de ne pas laisser les piles sèches avant d&#39;ajouter l&#39;anticorps. Ajouter 40 ul de solutions d&#39;anticorps dans les puits. Dans une bien ajouter Diluant anticorps seulement comme un contrôle négatif supplémentaire. </li></ol> 5. Sondes PLA <ol><li> Diluer les deux sondes de PLA (DuoLink II anti-Mouse MOINS et DuoLink II anti-lapin PLUS) 1:05 dans le diluant d&#39;anticorps. </li><li> Secouez la solution d&#39;anticorps primaire de la glisse. Laver les lames 2 fois 5 min chacun avec 1x DuoLink Buffer II lavage A dans une jarre de Coplin avec agitation à température ambiante. </li><li> Secouez le tampon de lavage A partir de diapositives et ajouter la solution de PLA sonde (40 ul / puits). Incuber les lames dans une chambre humide préchauffée pendant 1 h à 37 ° C. </li></ol> 6. Ligature <ol><li> Vortex le stock DuoLink Ligature II (5x) et diluer à 1:5 dans l&#39;eau de grande pureté et mélanger. Lors du calcul du volume de l&#39;eau, prendre en compte le volume de la ligase qui sera ajouté à une dilution finale de 1:40, juste avant l&#39;ajout du mélange dans les puits. </li><li> Secouez la solution de sonde PLA de la glisse. Laver les lames dans le tampon de lavage 1x A pour 2 fois 5 min chacun dans une jarre de Coplin avec agitation à température ambiante. </li><li> Sortez la ligase du congélateur à l&#39;aide d&#39;un bloc de congélation (-20 ° C). Ajouter la ligase de la solution de ligation (préparé en 6.1) à une dilution 1:40 et le vortex. </li><li> Secouez le tampon de lavage A partir de diapositives et ajouter la solution de ligation-ligase pour chaque puits (40 ul / puits). Incuber les lames dans une chambre humide préchauffée pendant 30 min à 37 ° C. </li></ol> 7. D&#39;amplification Remarque: Lumière réactifs sensibles. Gardez les diapositives abri de la lumière. <ol><li> Diluer le stock DuoLink Amplification II (5x) 1:5 dans de l&#39;eau de grande pureté et mélanger. Lors du calcul du volume de l&#39;eau de prendre en compte le volume de la polymérase qui sera ajouté à une dilution finale de 1:80 juste avant l&#39;addition du mélange d&#39;ee puits. </li><li> Secouez la solution ligature-ligase de la glisse. Laver les lames dans le tampon de lavage 1x A avec pour 2 fois 2 min chacun dans une jarre de Coplin avec agitation à température ambiante. </li><li> Sortez la polymérase du congélateur à l&#39;aide d&#39;un bloc de congélation (-20 ° C). Ajouter la polymérase à la solution d&#39;amplification (préparé en 7.1) à une dilution 1:80 et le vortex. </li><li> Secouez le tampon de lavage A partir de diapositives et ajouter la solution d&#39;amplification-polymérase dans chaque puits (40 ul / puits). Incuber les lames dans une chambre humide préchauffée pendant 100 min à 37 ° C. </li></ol> 8. Préparation pour l&#39;imagerie Remarque: Lumière réactifs sensibles. Gardez les diapositives abri de la lumière. <ol><li> Secouez la solution d&#39;amplification-polymérase de la glisse et de lavage pour 2 fois 10min chacun à 1x DuoLink II Laver tampon B dans une jarre de Coplin avec agitation à température ambiante. </li><li> Plonger les lames dans 0,1 x Laver B. Tampon </li><li> Enlever le silicone de la diapositive 16 ainsi complètement. Ajouter ~ 40μl de la Seconde DuoLink Milieu de montage avec DAPI sur la lamelle et doucement le placer sur les échantillons qu&#39;il en appuyant légèrement pour qu&#39;il n&#39;y ait pas de bulles d&#39;air sous la lamelle. Fixer et sceller la lamelle sur la lame avec du vernis à ongles. Attendez au moins 15min avant de procéder à l&#39;imagerie. </li><li> Analyser les échantillons avec un microscope confocal ou fluorescence. Obtenir des images numériques. </li></ol> 9. Quantification Remarque: Lumière réactifs sensibles. Gardez les diapositives abri de la lumière. <ol><li> Utilisez DuoLink ImageTool à compter les signaux sur les images pour obtenir une mesure du niveau de la signalisation. </li><li> Comparer les mesures et faire un graphique. </li></ol> 10. Les résultats représentatifs Le résultat d&#39;une expérience in situ de l&#39;APL montre aussi discret taches fluorescentes. L&#39;emplacement du signal dépend des protéines spécifiques étudiés. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2631/2631fig1.jpg" /> Figure 1. In situ PLA sur les cellules Neuro2a après stimulation BMP4. Les cellules ont été traitées avec 2 uM (inhibiteur de la voie BMP) dorsomorphin (A) ou 25 ng / ml BMP4 (B) pendant 60 min ou elle n&#39;est pas traitée (CE). Des anticorps contre P-Smad1/5/8 et Smad4 ont été utilisés pour détecter les complexes actifs dans A et B. Les anticorps primaires aP-Smad1/5/8 seul (C) et un seul Smad4 (D) ou d&#39;une omission du primaire anticorps (E) ont été utilisés comme témoins. Bleu: DAPI; rouge: signal de l&#39;APL. Les images ont été obtenues avec un microscope Leica SP5 confocale. (F) Les signaux de PLA ont été comptés avec le logiciel DuoLink ImageTool et le nombre moyen de taches dans le noyau par cellule est présenté dans le graphique. (G), les cellules ont été laissés Neuro2a non traitées ou traitées avec Dorsomorphin (2 pM) ou BMP4 (25 ng / ml) pendant 60 min. Les cellules ont été lysées et les protéines ont été soumis à SDS-PAGE et analysés par immunoempreinte avec aP-Smad1/5/8 et PCNA, comme le contrôle du chargement. (*) Non spécifiques bande. Notez que l&#39;anticorps aP-Smad1/5/8 ne peut pas distinguer entre les trois protéines différentes présentes dans un complexe avec Smad4.

<ol>
	<li>Miyazono, K., Kamiya, Y., Morikawa, M. B. o. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=morphogenetic+protein+receptors+and+signal+transduction.">morphogenetic protein receptors and signal transduction.</a> J Biochem. 147, 35-51 (2010).</li><li>Gustafsdottir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays+for+sensitive+and+specific+protein+analyses.">Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses.</a> Anal Biochem. 345, 2-9 (2005).</li><li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3, 995-1000 (2006).</li><li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li><li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism.">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nat Chem Biol. 4, 33-41 (2008).</li><li>Baan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+proximity+ligation+detection+of+c-Jun/AP-1+dimers+reveals+increased+levels+of+c-Jun/Fra1+complexes+in+aggressive+breast+cancer+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo.">In situ proximity ligation detection of c-Jun/AP-1 dimers reveals increased levels of c-Jun/Fra1 complexes in aggressive breast cancer cell lines in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 1982-1990 .</li><li>Massinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interaction+of+DYX1C1+with+estrogen+receptors+suggests+involvement+of+hormonal+pathways+in+dyslexia.">Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia.</a> Hum Mol Genet. 18, 2802-2812 (2009).</li><li>Thymiakou, E., Zannis, V. I., Kardassis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+interactions+between+liver+X+receptor/retinoid+X+receptor+and+Sp1+modulate+the+transcriptional+induction+of+the+human+ATP+binding+cassette+transporter+A1+gene+by+oxysterols+and+retinoids.">Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids.</a> Biochemistry. 46, 11473-11483 (2007).</li></ol>

La production de cette vidéo a été parrainé par l&#39;article OLINK qui fait un réactif utilisé dans la procédure de dosage de proximité ligature.

La visualisation des complexes de protéines in situ est en grande demande, notamment pour des études dans la signalisation où l&#39;interaction des protéines et modification des protéines sont les moyens que les cellules utilisent pour envoyer un signal de leur surface au noyau. Il n&#39;a pas été possible de visualiser et de quantifier les complexes entre deux protéines endogènes in situ avec immunofluorescence avant. Co-localisation des anticorps expositions de basse résolution et ne peut pas être utilisé pour visualiser une véritable interaction. APL est une nouvelle technique que les chercheurs ont commencé à utiliser dans différents systèmes avec un grand succès 6, 7. Ici, nous montrons comment utiliser l&#39;APL non seulement de visualiser mais aussi de quantifier les complexes endogènes entre les effecteurs Smad activées en aval de la stimulation de BMP au cours du temps. Nous avons utilisé différentes cellules de culture de tissus, y compris Neuro2a et s&#39;est appuyé sur les anticorps commerciaux soulevées dans différentes espèces (souris, un lapin et-Smad4 aP-Smad1/5/8) pour y parvenir (figure 1). Cette méthode nous a permis, pour la première fois, pour voir l&#39;activation de la BMP-effecteur complexes au fil du temps, et pas seulement la présence de l&#39;Smad1/5/8 phosphorylée, ce qui ne peut pas tous être impliqués dans des complexes actifs avec Smad4. Nous avons compté les signaux (figure 1F) et comparé la mesure avec la quantification obtenue à partir des cellules immuno-mêmes 8 (figure 1G). Nous avons conclu que le nombre de taches de fournir une mesure précise de la signalisation comparative des niveaux au fil du temps. La technique a également été appliqué sur d&#39;autres lignées cellulaires (HEK293T et Cos7) avec des résultats similaires (données non présentées). Le principe de la technologie est basée sur deux sondes unique fourni avec le kit DuoLink. Chaque sonde se compose d&#39;un PLA anticorps secondaire attachée à un oligonucléotide synthétique unique, qui agit comme un journaliste. La proximité de la sonde permet la ligature d&#39;ADN à l&#39;endroit exact où ces sondes sont attachées à proximité. La distance des oligonucléotides, qui permet l&#39;hybridation de l&#39;ADN et la ligature est petite (40nm &lt;) et par conséquent, seules protéines qui interagissent peut permettre la ligature. L&#39;ADN ligaturé peut alors être amplifiés et détectés par hybridation des oligonucléotides marqués de la séquence amplifiée. L&#39;amplification est spécifique car elle dépend des principes d&#39;hybridation ADN-ADN et fournit également une grande sensibilité que l&#39;ADN ligaturé est amplifié de plusieurs ordres résultant dans l&#39;amélioration de l&#39;événement ligature initiale. L&#39;ADN amplifié est détecté par hybridation avec des oligonucléotides marqués et produit un spot visible et assez grande. Comme les taches peuvent être comptés, le signal APL fournit non seulement l&#39;information spatiale exacte (l&#39;emplacement des événements d&#39;interaction) mais également un moyen objectif de quantifier ces événements 2-4. D&#39;autres techniques qui sont employées pour la détection d&#39;interactions entre protéines comprennent la co-immunoprécipitation, immunofluorescence et Fluorescent Resonance Energy Transfer (FRET). Co-immunoprécipitation sont largement utilisés permettant l&#39;isolement de complexes protéiques. La méthode est accompagnée par immunoblot ce qui signifie que les protéines doivent être exprimés à des niveaux relativement élevés pour être détectés. Les problèmes de bruit de fond élevé ou la liaison non spécifique de certaines protéines sur les billes sont parfois difficiles à surmonter dans la co-immunoprécipitation. En outre, les co-immunoprécipitation permettent la détection de protéines qui peuvent faire partie d&#39;un complexe protéique, mais ne peut pas distinguer ceux qui sont en très grande proximité physique interagissant les uns avec les autres. Par ailleurs, la co-immunoprécipitations ne peut pas fournir de quantification dans la résolution seule cellule ou d&#39;informations sur la localisation des complexes de protéines dans la cellule. Détection de co-existence de complexes protéine dans une cellule ou d&#39;un compartiment cellulaire par immunofluorescence est basé sur le chevauchement des signaux diffus et donc, a une faible résolution spatiale et ne peuvent pas fournir des informations précises sur les interactions entre protéines. La quantification du signal immunofluorescence peut être fait par estimation visuelle que si la différence est de plusieurs fois, et ne peuvent pas être tous exacts ou mesurables que les taches de PLA. FRET permet la visualisation des complexes de protéines dans les cellules vivantes et surmonte la nécessité d&#39;anticorps et l&#39;exposition de l&#39;épitope. Toutefois, FRET dépend généralement de la surexpression de protéines fusionnées artificielle, qui peut ne pas refléter les complexes protéine endogène comme dans l&#39;APL. Conditions de blocage dans le protocole de l&#39;APL sont critiques que l&#39;agrégation des anticorps peuvent se produire et d&#39;augmenter le fond. D&#39;autres conditions de blocage peut être trouvé dans les fiches produit des anticorps. Des contrôles appropriés avec omission des anticorps primaires et secondaires fournissent des informations sur ce qui peut avoir mal tourné et dont ils ont besoin d&#39;être toujours compris. Il est important de dépister des anticorps différents qui vont donner la moindre arrière-plan quand ils sont utilisés seuls et le meilleur signal quand ils sont ensemble. Fixation du CELls est essentiel que plus de la fixation peut provoquer des complexes protéiques pleinement dénaturent et dégradent, tandis que la fixation insuffisante peut conduire à la perte des complexes de protéines au cours des étapes de la procédure. Ceci peut être contrôlé en abaissant la concentration du fixateur de 3%, soit en limitant le temps de fixation. Toutefois, la fixation dépend aussi de savoir si les anticorps primaires reconnaissent les protéines dénaturées ou non. Comme la technique de l&#39;APL est très sensible, un soin particulier est nécessaire pour maintenir le temps d&#39;incubation et des conditions égales entre les micro échantillons différents. Les échantillons ne doivent pas être laissées à sécher à tous les cas avant la dernière étape. Le séchage des échantillons peut conduire à fond augmenté. L&#39;élimination complète de la solution de blocage est également essentiel afin d&#39;éviter de fond. Les tampons de lavage doivent toujours être amenés à température ambiante avant utilisation, comme à basse température ralentit les réactions enzymatiques. Pour le dépannage, se reporter au manuel du kit. Il est utile d&#39;utiliser les taches de déterminer la localisation sub-cellulaire du signal APL (ex. DAPI, l&#39;actine, etc.) Ici nous avons utilisé DAPI (dans le milieu de montage) pour colorer les noyaux. Le PLA est compatible avec l&#39;utilisation d&#39;immunofluorescence avec des anticorps pour déterminer le type de cellule ou un compartiment cellulaire (non représenté ici). Quantification précise qui peut être fait en comptant les signaux et l&#39;utilisation de logiciels spécifiques (Image Tool DuoLink, OLINK Biosience). En conclusion nous avons démontré comment utiliser in situ de l&#39;APL, l&#39;aide du kit de détection BMP DuoLink signalisation dans les cellules fixes et présenté ses avantages: facile à utiliser, hautement sensible, pas de fond, et une capacité unique à quantifier actifs signalisation des BMP in situ. La limitation de l&#39;application de cette technique pour étudier les interactions entre protéines différentes dépend de la disponibilité et la qualité des anticorps primaires qui reconnaissent les protéines de l&#39;enquête.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>GMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21710025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21063029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AutogenBioclear</td>
<td>7.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential Amino Acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11149068</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Pyruvate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11360070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin / Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25300-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>16-well chamber slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lab-Tek</td>
<td>178599</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polysine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0138</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>a-pSmad1/5/8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cell Signaling</td>
<td>9511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>a-Smad4 (B8) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
<td>sc-7966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dorsomorphin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>171260-10MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Recombinant Mouse BMP-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D</td>
<td>5020-BP-010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PFA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton-X 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>H5151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Detection Reagents (Orange)</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OLINK</td>
<td>92007-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>92004-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>92002-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Mounting Medium with DAPI</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>82040-0005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Wash Buffers Fluorescence</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>82049</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using in situ pla, a proximity ligation assay

Les PGB sont responsables pour une large gamme d&#39;effets sur le développement et biologiques. Récepteurs BMP activer (phosphoryler) le Smad1/5/8 effecteurs, qui ensuite, former un complexe avec Smad4 et translocation vers le noyau où ils fonctionnent comme des facteurs de transcription spécifiques pour initier BMP effets en aval 1. Traditionnel des techniques immuno-fluorescence avec des anticorps contre phospho-Smad peptides présentent une faible sensibilité, bruit de fond élevé et offrent une quantification brute car elles reposent sur l&#39;intensité du signal d&#39;anticorps particulier si ce n&#39;est photosensibles fluorescentes. En outre, les phospho-Smad ne peuvent pas tous être dans un complexe avec Smad4 et engagés dans la transcription active. In situ APL est une technologie capable de détecter les interactions entre protéines avec une haute spécificité et sensibilité 2-4. Cette reconnaissance nouvelle technologie d&#39;anticorps couples avec l&#39;amplification de l&#39;ADN porteuse de la protéine. Il génère une version localisée, signal discret dans une forme de taches révéler la position exacte de l&#39;événement de reconnaissance. Le nombre de signaux peuvent être comptés et comparés fournir une mesure. Nous avons appliqué in situ de l&#39;APL, l&#39;aide du kit DuoLink, avec une combinaison d&#39;anticorps qui permet la détection des effecteurs de signalisation BMP et phospho-Smad1/5/8 Smad4 que lorsque ces derniers sont dans IE proximité dans un complexe qui se produit uniquement avec de signalisation d&#39;activation. Cela a permis pour la première fois, la visualisation et la mesure de signalisation des BMP endogènes avec une haute spécificité et la sensibilité dans une expérience bien sûr le temps sous stimulation BMP4.

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Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Ici, nous montrons comment utiliser Assay ligature de proximité (APL), avec une combinaison d&#39;anticorps de visualiser des protéines morphogénétiques osseuses (BMP) de signalisation dans les cellules fixes. Cette technique nous a permis de suivre l&#39;accumulation nucléaire de BMP endogènes effectrices activées-complexes et de quantifier leur niveau au cours du temps sous BMP4 stimulation.

Détection de signalisation Effector-Complexes en aval de BMP4 aide In situ PLA, un dosage Ligature Proximité

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

detection-signaling-effector-complexes-downstream-bmp4-using-situ-pla

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

31.6K vues.  Imperial College, Hammersmith Hospital. Ici, nous montrons comment utiliser Assay ligature de proximité (APL), avec une combinaison d'anticorps de visualiser des protéines morphogénétiques osseuses (BMP) de signalisation dans les cellules fixes. Cette technique nous a permis de suivre l'accumulation nucléaire de BMP endogènes effectrices activées-complexes et de quantifier leur niveau au cours du temps sous BMP4 stimulation.

Vidéo: Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Homogène de détection rapide des essais biologiques utilisant un support magnétique Système de modulation Biosensing

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Recherche

Biologie

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics: détection d&#39;altérations numériques et structurelles dans les 24 chromosomes de l&#39;homme en utilisant simultanément un dosage FISH Novel OctoChrome

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

La détection de l&#39;ARN viral par fluorescence<em&gt; In situ</emHybridation&gt; (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Mesure des taux métabolique dans<em&gt; Drosophila</em&gt; En utilisant Respirométrie

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Détection et analyse de l&#39;ADN dommages souris muscle squelettique<em&gt; In Situ</em&gt; Utilisation de la méthode TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Un protocole pour Lentiviral transduction et analyse aval de intestinale organoïdes

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Détection de cibles miARN dans à haut débit utilisant le test de 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Here, we describe a procedure to visualize and quantify with high sensitivity the endogenous interactions between the endoplasmic reticulum and mitochondria in fixed cells. The protocol features an optimized in situ proximity ligation assay targeting the inositol 1,4,5-triphosphate receptor/glucose-regulated protein 75/voltage-dependent anion channel/cyclophilin D complex at the mitochondria-associated membrane interface.

Etude de réticulum endoplasmique et mitochondries Interactions par<em&gt; In Situ</em&gt; Proximité Ligation Assay dans des cellules fixes

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires careful and in-depth analyses and quantification to capture as much information about the underlying events as possible. Spatial, temporal and intensity parameters intrinsic to Ca2+ signals such as frequency, duration, propagation, velocity and amplitude may provide some biological information required for intracellular signalling. High-resolution Ca2+ imaging typically results in the acquisition of large data files that are time consuming to process in terms of translating the imaging information into quantifiable data, and this process can be susceptible to human error and bias. Analysis of Ca2+ signals from cells in situ typically relies on simple intensity measurements from arbitrarily selected regions of interest (ROI) within a field of view (FOV). This approach ignores much of the important signaling information contained in the FOV. Thus, in order to maximize recovery of information from such high-resolution recordings obtained with Ca2+dyes or optogenetic Ca2+ imaging, appropriate spatial and temporal analysis of the Ca2+ signals is required. The protocols outlined in this paper will describe how a high volume of data can be obtained from Ca2+ imaging recordings to facilitate more complete analysis and quantification of Ca2+ signals recorded from cells using a combination of spatiotemporal map (STM)-based analysis and particle-based analysis. The protocols also describe how different patterns of Ca2+ signaling observed in different cell populations in situ can be analyzed appropriately. For illustration, the method will examine Ca2+ signaling in a specialized population of cells in the small intestine, interstitial cells of Cajal (ICC), using GECIs.

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) have radically changed how in situ Ca2+ imaging is performed. To maximize data recovery from such recordings, appropriate analysis of Ca2+ signals is required. The protocols in this paper facilitate the quantification of Ca2+ signals recorded in situ using spatiotemporal mapping and particle-based analysis.

Applications de cartographie spatio-temporelle et Techniques d’analyse des particules pour quantifier la signalisation intracellulaire Ca2 + In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female Anopheles mosquitoes are transmitted to humans via mosquito bites during blood feeding. The presence of sporozoites in the mosquito salivary glands thus defines mosquito infectiousness. To determine whether an Anopheles mosquito carries Plasmodium sporozoites, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method has been the standard tool to detect the Plasmodium circumsporozoite protein (CSP), the major surface protein of the sporozoites. In this method, the head along with the thorax of each mosquito is separated from the abdomen, homogenized, and subjected to a sandwich ELISA to detect the presence of CSP specific to Plasmodium falciparum and each of the two subtypes, VK210 and VK247, of Plasmodium vivax.This method has been used to study malaria transmission, including the seasonal dynamics of mosquito infection and the species of the major malaria vectors in the study sites.

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

This protocol describes a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect salivary gland sporozoites in mosquitoes. Using easily available monoclonal antibodies, the method enables cost-effective, high-throughput detection of mosquitoes carrying Plasmodium falciparum or Plasmodium vivax. The method is suitable for malaria transmission research, including vector surveys.