Cette méthode offre une alternative à l’étiquetage conventionnel de fluorescence et à la procédure d’analyse de cytométrie de flux, qui prennent beaucoup de temps, sont coûteuses et encourent le risque de modifier la fonction cellulaire des échantillons. Le principal avantage de cette technique est la tomographie à indice réfractif tridimensionnel et l’apprentissage automatique sont des méthodes quantitatives et sans étiquette qui permettent une identification rapide et précise des lymphocytes. Les implications de cette technique s’étendent vers la thérapie des cancers du sang et des maladies auto-immunes car l’identification des lymphocytes peut être cruciale pour le diagnostic de la maladie et l’application appropriée de traitement.
Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu des populations de lymphocytes, elle peut également être appliquée à l’analyse d’autres cellules individuelles d’intérêt, y compris les bactéries. La démonstration visuelle de la technologie d’imagerie quantitative de phase 3D est essentielle, car elle facilite une instruction claire sur la façon d’exécuter la technique et peut fournir un aperçu de ses applications. Commencez par recueillir chaque sous-ensemble de lymphocytes par tri cellulaire activé par fluorescence.
Pour une imagerie optimale, diluer chaque échantillon cellulaire à une concentration de 180 cellules par microlitre de milieu RPMI, et injecter lentement 120 microlitres du premier échantillon dilué dans une chambre d’imagerie. Après avoir confirmé l’absence de bulles dans la chambre, placez une goutte d’eau distillée sur la lentille objective d’un microscope de phase quantitative 3D et placez la chambre d’imagerie sur l’étape de traduction du microscope. Ajustez l’étape de sorte que l’échantillon s’aligne avec la lentille objective, et cliquez sur la mise au point et la surface dans l’onglet d’étalonnage de la perspective microscope du logiciel d’imagerie pour ajuster les positions axiaales des lentilles objectif et condenseur, respectivement.
Cliquez sur le mode Automatique pour aligner les lentilles objectif et condenseur. Pour optimiser l’alignement, ouvrez le mode numérisation et ajustez manuellement les lentilles pour aligner le modèle numérique de périphérique micromirror au centre. Ensuite, revenez en mode Normal et ajustez l’étape de traduction pour localiser une cellule dans le champ de vision.
Ajustez la position axial de la lentille objective pour trouver le plan focal jusqu’à ce que la limite de l’échantillon visualisée dans l’écran soit presque invisible. Il est important d’ajuster parfaitement l’orientation de la cellule pour générer une tomographie 3DRI optimale. Si l’image n’est pas prise correctement, la reconstruction 3D sera altérée, ce qui entraîne une tomogramme bruyante.
Ajustez l’étape de traduction pour trouver un emplacement sans cellule et cliquez sur Calibrate pour mesurer plusieurs hologrammes 2D avec différents angles d’éclairage. Ajustez l’étape de traduction pour localiser une cellule au centre du champ de vision. Et sous l’onglet Acquisition, nommez l’échantillon en cours d’image.
Cliquez sur instantané 3D pour mesurer les hologrammes de la cellule en utilisant les mêmes angles d’éclairage que pour les hologrammes 2D juste mesurés. Lorsque les données acquises apparaissent dans le panneau de gestion des données, cliquez à droite sur les données et cliquez sur Processus pour reconstruire un tomogramme d’index réfractif 3D à partir des hologrammes 2D à l’aide de l’algorithme de tomographie de défraction mis en œuvre dans le logiciel d’imagerie. Après l’imagerie, dans le panneau gestion des données, cliquez à droite sur les données et cliquez sur Ouvrir pour visualiser les données.
Cliquez sur le centre de la cellule pour le repositionner et cliquez sur RI Tomogram sur le panneau Data Manager. Sur l’onglet Preset cliquez sur Charge et double clic lymphocyte. xml, qui est une fonction de transfert prédéfinie fournie par le logiciel d’imagerie pour visualiser la tomographie selon les distributions 3DRI.
Faites défiler la souris pour zoomer et faites glisser la cellule pour la faire pivoter dans n’importe quelle direction. Pour l’extraction quantitative des caractéristiques morphologiques et biochimiques, placez toutes les données tomographiques dans un seul dossier et divisez les types de cellules dans les sous-composants individuels dans le dossier principal. Ensuite, ouvrez le fichier d’extraction de fonctionnalités supplémentaires dans le logiciel d’imagerie approprié et modifiez la ligne 14 pour désigner le dossier de tomographie à partir duquel les données doivent être extraites.
Modifier la ligne 15 pour désigner le dossier auquel les données de fonctionnalité extraites doivent être enregistrées et exécuter le code. Pour chaque tomogramme de l’ensemble de données, le code calculera la surface, le volume cellulaire, la sphérité, la densité des protéines et la masse sèche par seuil d’index réfractif. Pour l’apprentissage supervisé et l’identification, utilisez l’algorithme simple de fractionnement aléatoire dans MATLAB pour diviser aléatoirement les données de fonctionnalités extraites en dossiers distincts de formation et d’ensemble de tests.
Ouvrez le fichier de formation supplémentaire et modifiez la ligne 14 pour désigner le dossier d’ensemble de formation, la ligne 16 pour désigner le dossier pour enregistrer le classificateur formé et la ligne 17 pour définir un nom de fichier pour le classificateur. Ensuite, exécutez le code. En utilisant les fonctionnalités sélectionnées de l’ensemble de formation, le code formera un classificateur avec l’algorithme voisin le plus proche K et enregistrera le classificateur dans le dossier désigné.
Ensuite, ouvrez le fichier de test supplémentaire trois, et modifiez les lignes 14 à 15 pour désigner le classificateur formé à tester et la ligne 17 pour désigner l’ensemble de test formé. Ensuite, exécutez le code. Le classificateur identifiera les types de cellules des lymphocytes individuels dans l’ensemble d’essai.
Ici, des tomogrammes d’index réfractifs représentatifs rendus en 3D des lymphocytes B, des lymphocytes T positifs CD4 et des lymphocytes T positifs CD8 avec différents schémas de couleurs, attribués en fonction des valeurs d’index réfractives attribuées via le logiciel d’imagerie sont affichés. À partir des valeurs de l’indice réfractaire, les caractéristiques quantitatives morphologiques et biochimiques peuvent être calculées. Dans cette expérience, l’exactitude de la classification des lymphocytes T et B était de 93,15 % et de 89,81 % respectivement pour les cas de formation et de test.
Les lymphocytes T positifs CD4 et CD8 ont été classés statistiquement, et l’exactitude était de 87,41 % et 84,38 % respectivement pour les ensembles de formation et de test. Enfin, la précision du classificateur de type cellulaire multiclasse était de 80,65 % et de 75,93 % respectivement pour les étapes de formation et de test. La qualité et le nombre d’images sont essentiels au succès de cette technique.
Plus la qualité de l’image est bonne et plus le volume de données est élevé, meilleure est la précision de l’identification. L’apprentissage profond peut être utilisé pour analyser plus complètement les données complexes des tomogrammes, améliorant fortement les performances d’identification. De plus, la fluorescence et l’imagerie quantitative de phase 3D peuvent être utilisées pour étudier la trajectoire des rôles physiologiques des lymphocytes identifiés.
Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans les domaines de la biologie cellulaire et de la biomédecine pour explorer des maladies spécifiques d’intérêt dans différents organismes. En effet, les immunologistes en particulier, peuvent bénéficier de l’utilisation de cette nouvelle technologie pour identifier la population d’intérêt.
