Diese Methode bietet eine Alternative zur herkömmlichen Fluoreszenzkennzeichnung und dem Prozess der Durchflusszytometrie, die zeitaufwändig, kostspielig und das Risiko einer Änderung der zellulären Funktion der Proben darstellen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die dreidimensionale Refractive Index Tomographie und maschinelles Lernen sind etikettenfreie und quantitative Methoden, die eine schnelle und genaue Lymphozytenidentifikation ermöglichen. Die Implikationen dieser Technik reichen auf die Therapie von Blutkrebs und Autoimmunerkrankungen, da die Identifizierung von Lymphozyten für die Diagnose von Krankheiten und die angemessene Anwendung der Behandlung von entscheidender Bedeutung sein kann.
Obwohl diese Methode Einblick in Lymphozytenpopulationen geben kann, kann sie auch auf die Analyse anderer einzelner Voninteresseer Zellen, einschließlich Bakterien, angewendet werden. Die visuelle Demonstration der quantitativen 3D-Phasenbildgebungstechnologie ist von entscheidender Bedeutung, da sie eine klare Anleitung zur Ausführung der Technik ermöglicht und Einblicke in ihre Anwendungen geben kann. Beginnen Sie mit dem Sammeln jeder Lymphozyten-Submenge durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung.
Für eine optimale Bildgebung verdünnen Sie jede Zellprobe auf eine Konzentration von 180 Zellen pro Mikroliter RPMI-Medium und injizieren Sie langsam 120 Mikroliter der ersten verdünnten Probe in eine Bildkammer. Nachdem Sie einen Mangel an Blasen in der Kammer bestätigt haben, legen Sie einen Tropfen destilliertes Wasser auf die Objektivlinse eines 3D-quantitativen Phasenmikroskops und legen Sie die Bildkammer auf die Übersetzungsstufe des Mikroskops. Passen Sie die Stufe so an, dass die Probe an der Objektivlinse ausgerichtet ist, und klicken Sie auf Fokus und Oberfläche in der Kalibrierungsregisterkarte der Mikroskopperspektive der Bildgebungssoftware, um die axialen Positionen der Objektiv- bzw. Kondensatorlinsen anzupassen.
Klicken Sie auf Auto-Modus, um die Objektiv- und Kondensatorlinsen auszurichten. Um die Ausrichtung zu optimieren, öffnen Sie den Scanmodus, und passen Sie die Linsen manuell an, um das digitale Mikrospiegel-Gerätemuster an der Mitte auszurichten. Kehren Sie dann in den Modus Normal zurück, und passen Sie die Übersetzungsphase an, um eine Zelle im Sichtfeld zu finden.
Passen Sie die axiale Position der Objektivlinse an, um die Brennebene zu finden, bis die im Bildschirm visualisierte Probengrenze fast unsichtbar ist. Es ist wichtig, den Fokus der Zelle perfekt einzustellen, um ein optimales 3DRI-Tomogramm zu erzeugen. Wenn das Bild nicht richtig aufgenommen wird, wird die 3D-Rekonstruktion beeinträchtigt, was zu einem lauten Tomogramm führt.
Passen Sie die Übersetzungsstufe an, um eine Position ohne Zelle zu finden, und klicken Sie auf Kalibrieren, um mehrere 2D-Hologramme mit unterschiedlichen Beleuchtungswinkeln zu messen. Passen Sie die Übersetzungsphase an, um eine Zelle in der Mitte des Sichtfelds zu finden. Und benennen Sie unter der Registerkarte "Anschaffung" das abbildende Beispiel.
Klicken Sie auf 3D-Snapshot, um die Hologramme der Zelle mit den gleichen Beleuchtungswinkeln wie bei den gerade gemessenen 2D-Hologrammen zu messen. Wenn die erfassten Daten im Datenverwaltungsfenster angezeigt werden, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Daten, und klicken Sie auf Prozess, um ein 3D-Refractive-Indextomogramm aus den 2D-Hologrammen mithilfe des in der Bildverarbeitungssoftware implementierten Defraktionstomographiealgorithmus zu rekonstruieren. Klicken Sie nach der Abbildung im Bedienfeld Datenmanagement mit der rechten Maustaste auf die Daten, und klicken Sie auf Öffnen, um die Daten zu visualisieren.
Klicken Sie auf die Mitte der Zelle, um sie neu zu positionieren, und klicken Sie im Bedienfeld "Daten-Manager" auf RI Tomogramm. Klicken Sie auf der Registerkarte Voreinstellung auf Laden und doppelklicken Sie auf Lymphozyte. xml, eine vordefinierte Übertragungsfunktion, die von der Imaging-Software zur Visualisierung des Tomogramms gemäß den 3DRI-Verteilungen bereitgestellt wird.
Scrollen Sie mit der Maus, um zu vergrößern, und ziehen Sie die Zelle, um sie in eine beliebige Richtung zu drehen. Für quantitative morphologische und biochemische Merkmalsextraktion platzieren Sie alle tomographischen Daten in einem einzigen Ordner und teilen Sie die Zelltypen in einzelne Unterordner im Hauptordner auf. Öffnen Sie als Nächstes die zusätzliche Feature-Extraktionsdatei in der entsprechenden Bildverarbeitungssoftware, und bearbeiten Sie Zeile 14, um den Tomogrammordner anzugeben, aus dem die Daten extrahiert werden sollen.
Bearbeiten Sie Zeile 15, um den Ordner festzulegen, in dem die extrahierten Feature-Daten gespeichert werden sollen, und führen Sie den Code aus. Für jedes Tomogramm im Dataset berechnet der Code die Oberfläche, das Zellvolumen, die Sphärizität, die Proteindichte und die Trockenmasse pro Brechungsindexschwelle. Verwenden Sie für das überwachte Lernen und die Identifizierung den einfachen Zufallssplitting-Algorithmus in MATLAB, um die extrahierten Feature-Daten nach dem Zufallsprinzip in separate Trainings- und Testsatzordner aufzuteilen.
Öffnen Sie die Zusatztrainingsdatei, und bearbeiten Sie Zeile 14, um den Schulungssatzordner, Zeile 16 zum Speichern des trainierten Klassifiierers und Zeile 17 zum Festlegen eines Dateinamens für den Klassifier festzulegen. Führen Sie dann den Code aus. Mithilfe der ausgewählten Features des Trainingssatzes trainiert der Code einen Klassifier mit dem K-Nächstenalgorithmus und speichert den Klassifier im angegebenen Ordner.
Öffnen Sie anschließend die zusätzliche Testdatei drei, und bearbeiten Sie die Zeilen 14 bis 15, um den zu testenden trainierten Klassifier und Zeile 17 zum Festlegen des trainierten Testsatzes anzugeben. Führen Sie dann den Code aus. Der Klassifier identifiziert die Zelltypen der einzelnen Lymphozyten im Testsatz.
Hier werden repräsentative 3D-gerenderte Brechungsindex-Tomogramme von B-Lymphozyten, CD4-positiven T-Lymphozyten und CD8-positiven T-Lymphozyten mit unterschiedlichen Farbschemata gezeigt, die gemäß den über die Bildgebungssoftware zugewiesenen Brechungsindexwerten zugeordnet sind. Aus den Brechungsindexwerten können quantitative morphologische und biochemische Merkmale berechnet werden. In diesem Experiment betrug die Genauigkeit der T- und B-Lymphozytenklassifikation 93,15 % bzw. 89,81 % für die Trainings- und Testfälle.
Die CD4-positiven und CD8-positiven T-Lymphozyten wurden statistisch klassifiziert, und die Genauigkeit betrug 87,41 % bzw. 84,38 % für die Trainings- und Testsätze. Schließlich betrug die Genauigkeit des mehrklassigen Zelltypklassifiers 80,65 % bzw. 75,93 % für die Trainings- und Testphasen. Die Qualität und Anzahl der Bilder ist entscheidend für den Erfolg dieser Technik.
Je besser die Bildqualität und je höher das Datenvolumen, desto besser ist die Genauigkeit der Identifikation. Deep Learning kann verwendet werden, um die komplexen Daten der Tomogramme vollständiger zu analysieren und so die Identifikationsleistung zu verbessern. Darüber hinaus können Fluoreszenz und 3D-quantitative Phasenbildgebung verwendet werden, um den Weg der physiologischen Rollen der identifizierten Lymphozyten zu untersuchen.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in den Bereichen Zellbiologie und Biomedizin, um spezifische Krankheiten von Interesse in verschiedenen Organismen zu erforschen. Insbesondere Immunologen können von der Nutzung dieser neuen Technologie zur Identifizierung der Bevölkerung von Interesse profitieren.
