Este método fornece uma alternativa ao procedimento convencional de rotulagem de fluorescência e análise de citometria de fluxo, que são demorados, caros e incorrem no risco de alterar a função celular das amostras. A principal vantagem dessa técnica é que a tomografia tridimensional do índice de refração e o aprendizado de máquina são métodos livres de rótulos e quantitativos que permitem uma identificação rápida e precisa do linfócito. As implicações dessa técnica se estendem à terapia de cânceres de sangue e doenças autoimunes, pois a identificação de linfócitos pode ser crucial para o diagnóstico da doença e a aplicação adequada do tratamento.
Embora este método possa fornecer insights sobre populações de linfócitos, ele também pode ser aplicado à análise de outras células únicas de interesse, incluindo bactérias. A demonstração visual da tecnologia de imagem de fase quantitativa 3D é fundamental, pois facilita uma instrução clara de como executar a técnica e pode fornecer insights sobre suas aplicações. Comece coletando cada subconjunto de linfócitos por triagem celular ativada por fluorescência.
Para uma imagem ideal, diluir cada amostra celular para uma concentração de 180 células por microliter de meio RPMI, e injetar lentamente 120 microlitres da primeira amostra diluída em uma câmara de imagem. Depois de confirmar a falta de bolhas dentro da câmara, coloque uma gota de água destilada na lente objetiva de um microscópio de fase quantitativa 3D, e coloque a câmara de imagem no estágio de tradução do microscópio. Ajuste o estágio para que a amostra se alinhe com a lente objetiva, e clique no foco e na superfície na guia de calibração da perspectiva do microscópio do software de imagem para ajustar as posições axiais das lentes objetivas e condensadoras, respectivamente.
Clique no modo Automático para alinhar as lentes objetivas e condensadoras. Para otimizar o alinhamento, abra o modo de digitalização e ajuste manualmente as lentes para alinhar o padrão do dispositivo micromor digital ao centro. Em seguida, retorne ao modo Normal e ajuste o estágio de tradução para localizar uma célula no campo de visão.
Ajuste a posição axial da lente objetiva para encontrar o plano focal até que o limite da amostra visualizado na tela seja quase invisível. É importante ajustar perfeitamente o foco da célula para gerar um tomograma ótimo de 3DRI. Se a imagem não for tomada corretamente, a reconstrução 3D será prejudicada, resultando em um tomograma barulhento.
Ajuste o estágio de tradução para encontrar um local sem uma célula e clique em Calibrar para medir vários hologramas 2D com diferentes ângulos de iluminação. Ajuste o estágio de tradução para localizar uma célula no centro do campo de visão. E sob a guia Aquisição, nomeie a amostra sendo imageda.
Clique em Snapshot 3D para medir os hologramas da célula usando os mesmos ângulos de iluminação que os hologramas 2D apenas medidos. Quando os dados adquiridos aparecerem no painel Gerenciamento de Dados, clique com o botão direito do mouse nos dados e clique em Processo para reconstruir um tomograma de índice de refração 3D a partir dos hologramas 2D usando o algoritmo de tomografia defraction implementado no software de imagem. Após a imagem, no painel Gerenciamento de Dados, clique com o botão direito do mouse nos dados e clique em Abrir para visualizar os dados.
Clique no centro da célula para reposicioná-lo e clique em RI Tomogram no painel Data Manager. Na guia Predefinição clique em Carregar e clique duas vezes no linfócito. xml, que é uma função de transferência predefinida fornecida pelo software de imagem para visualizar o tomograma de acordo com as distribuições 3DRI.
Role o mouse para ampliar e arraste a célula para rodá-lo em qualquer direção. Para extração quantitativa de recursos morfológicos e bioquímicos, coloque todos os dados tomográficos em uma única pasta e divida os tipos de células dentro de subpatas individuais na pasta principal. Em seguida, abra o arquivo de extração de recursos suplementares no software de imagem apropriado e edite a linha 14 para designar a pasta de tomograma da qual os dados devem ser extraídos.
Editar a linha 15 para designar a pasta à qual os dados do recurso extraídos devem ser salvos e executar o código. Para cada tomograma no conjunto de dados, o código calculará a área de superfície, volume celular, esfericidade, densidade proteica e massa seca por limiar de índice refrativo. Para aprendizado e identificação supervisionados, use o algoritmo de divisão aleatória simples no MATLAB para dividir aleatoriamente os dados do recurso extraído em pastas separadas de treinamento e conjunto de testes.
Abra o arquivo de treinamento suplementar e edite a linha 14 para designar a pasta do conjunto de treinamento, a linha 16 para designar a pasta para salvar o classificador treinado e a linha 17 para definir um nome de arquivo para o classificador. Então execute o código. Usando as características selecionadas do conjunto de treinamento, o código treinará um classificador com o algoritmo vizinho mais próximo K e salvará o classificador na pasta designada.
Em seguida, abra o arquivo de teste suplementar três e edite as linhas 14 a 15 para designar o classificador treinado a ser testado e a linha 17 para designar o conjunto de testes treinado. Então execute o código. O classificador identificará os tipos celulares dos linfócitos individuais no conjunto de testes.
Aqui representativo 3D renderizado indicador de índice refrativo de linfócitos B, linfócitos T positivos CD4 e linfócitos T positivos CD8 com diferentes esquemas de cores, alocados de acordo com os valores de índice de refração atribuídos através do software de imagem são mostrados. A partir do índice refrativo podem ser calculados os valores quantitativos morfológicos e bioquímicos. Neste experimento, a precisão da classificação de linfócitos T e B foi de 93,15% e 89,81% para os casos de treinamento e teste, respectivamente.
Os linfócitos T positivos CD4 e CD8 foram classificados estatisticamente, e a precisão foi de 87,41% e 84,38% para os conjuntos de treinamento e teste, respectivamente. Por fim, a precisão do classificador multiclasse, tipo celular, foi de 80,65% e 75,93% para as etapas de treinamento e teste, respectivamente. A qualidade e o número de imagens são essenciais para o sucesso dessa técnica.
Quanto melhor a qualidade da imagem e maior o volume de dados, maior a precisão da identificação. O aprendizado profundo pode ser usado para analisar mais completamente os dados complexos dos tomogramas, melhorando o desempenho de identificação. Além disso, fluorescência e imagem de fase quantitativa 3D podem ser usados para investigar o caminho dos papéis fisiológicos dos linfócitos identificados.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores das áreas de biologia celular e biomedicina explorarem doenças específicas de interesse dentro de diferentes organismos. De fato, os imunologistas, em particular, podem se beneficiar do uso dessa nova tecnologia para identificar população de interesse.
