Bu yöntem, zaman alan, maliyetli ve numunelerin hücresel işlevini değiştirme riskitaşıyan geleneksel floresan etiketleme ve akış sitometri sitometrisi analizi prosedürüne alternatif sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, hızlı ve doğru lenfosit tanımlamasını sağlayan etiketsiz ve nicel yöntemler olan üç boyutlu refraktif indeks tomografisi ve makine öğrenimidir. Lenfositlerin belirlenmesi gibi bu tekniğin etkileri kan kanserlerinin ve otoimmün hastalıkların tedavisine doğru uzanır hastalık tanısı ve uygun tedavi uygulaması için çok önemli olabilir.
Bu yöntem lenfosit popülasyonları içine fikir sağlayabilir rağmen, aynı zamanda bakteriler de dahil olmak üzere ilgi diğer tek hücrelerin analizi için uygulanabilir. Tekniğin nasıl gerçekleştirilebileceğine dair net bir talimatı kolaylaştıran ve uygulamalarına ışık verebildiği için, 3B nicel faz görüntüleme teknolojisinin görsel gösterimi çok önemlidir. Floresan aktive hücre sıralama ile her lenfosit alt toplayarak başlayın.
Optimal görüntüleme için, her hücre örneğini RPMI ortamının mikrolitresi başına 180 hücre konsantrasyonuna seyreltin ve yavaş yavaş ilk seyreltilmiş numunenin 120 mikrolitresini bir görüntüleme odasına enjekte edin. Oda içinde kabarcıkların eksikliğini doğruladıktan sonra, 3B kantitatif faz mikroskobunun objektif merceği üzerine bir damla distile su yerleştirin ve görüntüleme odasını mikroskobun çeviri aşamasına yerleştirin. Aşamayı, numunenin nesnel lensle aynı hizaya uyacak şekilde ayarlayın ve sırasıyla nesnel ve kondansatör lenslerin eksenel konumlarını ayarlamak için görüntüleme yazılımının mikroskop perspektifinin kalibrasyon sekmesinde odak ve yüzeye tıklayın.
Objektif ve kondansatör lensleri hizalamak için Otomatik mod'a tıklayın. Hizalamayı optimize etmek için Tarama modunu açın ve dijital mikroayna cihaz desenini merkeze hizalamak için lensleri manuel olarak ayarlayın. Ardından, Normal moduna dönün ve görünüm alanında bir hücre bulmak için çeviri aşamasını ayarlayın.
Ekranda görselleştirilen örnek sınır neredeyse görünmez olana kadar odak düzlemini bulmak için objektif lensin eksenel konumunu ayarlayın. En iyi 3DRI tomogramı oluşturmak için hücrenin odak noktasını mükemmel bir şekilde ayarlamak önemlidir. Görüntü düzgün alınmazsa, 3D rekonstrüksiyon bozulur ve bu da gürültülü bir tomograma neden olur.
Hücresi olmayan bir konumu bulmak için çeviri aşamasını ayarlayın ve farklı aydınlatma açılarına sahip birden fazla 2D hologramı ölçmek için Kalibrasyon'u tıklatın. Görünüm alanının merkezinde bir hücre bulmak için çeviri aşamasını ayarlayın. Ve Edinme sekmesinin altında, görüntüalınan örneği adlandırın.
Sadece ölçülen 2B hologramlar için aynı aydınlatma açıları kullanarak hücrenin hologramları ölçmek için 3B Snapshot'ı tıklatın. Elde edilen veriler Veri Yönetimi panelinde göründüğünde, görüntüleme yazılımında uygulanan kınık tomografi algoritmasını kullanarak 2B hologramlardan 3B kırılma indisi tomogramını yeniden oluşturmak için verileri sağ tıklatın ve İşlem'i tıklatın. Görüntülemeden sonra, Veri Yönetimi panelinde, verilere sağ tıklayın ve verileri görselleştirmek için Aç'ı tıklatın.
Yeniden konumlandırmak için hücrenin ortasını tıklatın ve Veri Yöneticisi panelinde RI Tomogram'ı tıklatın. Önceden Ayarlanmış sekmesinde Yükle'yi tıklatın ve lenfositi çift tıklatın. 3DRI dağılımlarına göre tomogramı görselleştirmek için görüntüleme yazılımı tarafından sağlanan önceden tanımlanmış bir aktarım fonksiyonu olan xml.
Yakınlaştırmak için fareyi kaydırın ve hücreyi herhangi bir yöne döndürmek için sürükleyin. Kantitatif morfolojik ve biyokimyasal özellik çıkarma için tüm tomografik verileri tek bir klasöre yerleştirin ve hücre türlerini ana klasördeki tek tek alt klasörler içinde bölün. Ardından, uygun görüntüleme yazılımındaki ek özellik çıkarma dosyasını açın ve verilerin ayıklanması gereken tomogram klasörünü belirlemek için satır 14'ü düzenleyin.
Ayıklanan özellik verilerinin kaydedilen klasörü belirlemek ve kodu yürütmek için satırı 15'i düzenleyin. Veri kümesindeki her tomogram için kod yüzey alanını, hücresel hacmi, herbiri kadar olan protein yoğunluğunu ve kırılma indisi başına kuru kütleyi hesaplar. Denetimli öğrenme ve tanımlama için, çıkarılan özellik verilerini rasgele ayrı eğitim ve test seti klasörlerine bölmek için MATLAB'daki basit rasgele bölme algoritmasını kullanın.
Ek eğitim dosyasını açın ve eğitim kümesi klasörünü belirlemek için satırı 14'ü, eğitilen sınıflayıcıyı kaydetmek için klasörü belirlemek için 16 satırını ve sınıflandırıcı için bir dosya adı ayarlamak için 17 satırını düzenleyin. O zaman kodu çalıştır. Eğitim kümesinin seçili özelliklerini kullanarak, kod K en yakın komşu algoritması ile bir sınıflandırıcı eğitir ve sınıflandırıcıyı belirlenen klasöre kaydeder.
Ardından, ek test dosyasını üç açın ve test edilecek eğitilmiş sınıflandırıcıyı belirlemek için 14 ile 15 arası satırları ve eğitilmiş test kümesini belirlemek için 17. O zaman kodu çalıştır. Sınıflandırıcı test kümesinde bireysel lenfositlerin hücre tiplerini tanımlar.
Burada temsili 3D b lenfositlerin kırılma indeksi tomogramları, CD4 pozitif T lenfositler ve farklı renk şemaları ile CD8 pozitif T lenfositler, görüntüleme yazılımı ile atanan kırılma indeks değerlerine göre tahsis gösterilmiştir. Kırılma indisi değerlerinden nicel morfolojik ve biyokimyasal özellikler hesaplanabilir. Bu deneyde eğitim ve test olgularında T ve B lenfosit sınıflamının doğruluğu sırasıyla %93.15 ve %89.81 idi.
CD4 pozitif ve CD8 pozitif T lenfositleri istatistiksel olarak sınıflandırıldı ve doğruluk oranı sırasıyla eğitim ve test setleri için %87.41 ve %84.38 idi. Son olarak, çok sınıflı, hücre tipi sınıflandırıcının doğruluğu eğitim ve test aşamaları için sırasıyla %80,65 ve %75,93 idi. Görüntü kalitesi ve sayısı bu tekniğin başarısı için gereklidir.
Görüntü kalitesi ne kadar iyi ve veri hacmi ne kadar yüksekse, tanımlamanın doğruluğu da o kadar iyi. Derin öğrenme, tomogramların karmaşık verilerini daha iyi analiz etmek ve tanımlama performansını artırmak için kullanılabilir. Ayrıca, floresan ve 3D kantitatif faz görüntüleme tanımlanan lenfositlerin fizyolojik rollerinin yolunu araştırmak için kullanılabilir.
Bu teknik, geliştirildikten sonra hücre biyolojisi ve biyotıp alanlarında ki araştırmacıların farklı organizmalar içinde belirli ilgi çekici hastalıkları keşfetmelerinin önünü açmıştır. Gerçekten de, özellikle immünolojistler, ilgi nüfusunu tanımlamak için bu yeni teknolojiyi kullanarak yararlanabilir.
