이 방법은 기존의 형광 라벨링 및 유동 세포 측정 분석 절차에 대한 대안을 제공하며, 이는 시간이 많이 소요되고 비용이 많이 들며 시료의 세포 기능을 변경할 위험이 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 3차원 굴절지수 단층 촬영과 기계 학습은 신속하고 정확한 림프구 식별을 가능하게 하는 라벨이 없고 정량적인 방법입니다. 림프구의 식별이 질병 진단 및 적절한 치료 응용 프로그램에 중요 할 수 있기 때문에이 기술의 의미는 혈액 암과 자가 면역 질환의 치료로 확장됩니다.
이 방법은 림프구 집단에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만 박테리아를 포함한 다른 단일 세포의 분석에도 적용 될 수 있습니다. 3D 정량적 단계 이미징 기술의 시각적 데모는 기술을 수행하는 방법에 대한 명확한 지침을 용이하게하고 응용 프로그램에 대한 통찰력을 제공 할 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 형광 활성화 세포 분류에 의해 각 림프구 하위 집합을 수집하여 시작합니다.
최적의 이미징을 위해 각 세포 샘플을 RPMI 배지의 마이크로리터 당 180개의 세포 농도로 희석하고 첫 번째 희석 된 샘플의 120 마이크로 리터를 이미징 챔버에 천천히 주입하십시오. 챔버 내의 거품 부족을 확인한 후, 3D 정량상 현미경의 객관적인 렌즈에 증류수 한 방울을 놓고 이미징 챔버를 현미경의 번역 단계에 놓습니다. 시료가 객관적인 렌즈와 정렬되도록 스테이지를 조정하고, 이미징 소프트웨어의 현미경 원근의 교정 탭에서 초점과 표면을 클릭하여 목표 및 응축렌즈렌즈의 축 위치를 각각 조정한다.
자동 모드를 클릭하여 목표 및 콘덴서 렌즈를 정렬합니다. 정렬을 최적화하려면 스캐닝 모드를 열고 수동으로 렌즈를 조정하여 디지털 마이크로미러 장치 패턴을 중앙에 정렬합니다. 그런 다음 일반 모드로 돌아가 서 번역 단계를 조정하여 뷰 필드에 셀을 찾습니다.
화면에 시각화된 샘플 경계가 거의 보이지 않게 될 때까지 목표 렌즈의 축 위치를 조정하여 초점 평면을 찾습니다. 최적의 3DRI 토모그램을 생성하기 위해 셀의 초점을 완벽하게 조정하는 것이 중요합니다. 이미지를 제대로 촬영하지 않으면 3D 재구성이 손상되어 시끄러운 토모그램이 발생합니다.
번역 단계를 조정하여 셀이 없는 위치를 찾고 교정을 클릭하여 다양한 조명 각도로 여러 2D 홀로그램을 측정합니다. 번역 단계를 조정하여 뷰 필드의 중심에 셀을 찾습니다. 그리고 획득 탭 에서 이미지되는 샘플의 이름을 지정합니다.
방금 측정된 2D 홀로그램과 동일한 조명 각도를 사용하여 셀의 홀로그램을 측정하려면 3D 스냅샷을 클릭합니다. 수집된 데이터가 데이터 관리 패널에 나타나면 데이터를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 프로세스를 클릭하여 이미징 소프트웨어에서 구현된 절전 단층 촬영 알고리즘을 사용하여 2D 홀로그램에서 3D 굴절률 토모그램을 재구성합니다. 이미징 을 한 후 데이터 관리 패널에서 데이터를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 열기를 클릭하여 데이터를 시각화합니다.
셀의 중심을 클릭하여 재배치하고 데이터 관리자 패널에서 RI Tomogram을 클릭합니다. 사전 설정 탭에서 로드를 클릭하고 림프구를 두 번 클릭합니다. xml은 3DRI 분포에 따라 토모그램을 시각화하기 위해 이미징 소프트웨어에서 제공하는 미리 정의된 전송 기능입니다.
마우스를 스크롤하여 셀을 확대하여 드래그하여 방향을 회전시합니다. 정량적 형태학적 및 생화학 적 특징 추출의 경우 모든 지형 데이터를 단일 폴더에 배치하고 메인 폴더의 개별 하위 폴더 내에서 세포 유형을 분할합니다. 다음으로, 적절한 이미징 소프트웨어에서 보충 기능 추출 파일을 열고 14줄을 편집하여 데이터를 추출할 토모그램 폴더를 지정합니다.
15줄을 편집하여 추출된 피쳐 데이터를 저장하고 코드를 실행하는 폴더를 지정합니다. 데이터 세트의 모든 토모그램에 대해 코드는 굴절률 임계값당 표면적, 세포 부피, 구형, 단백질 밀도 및 건질량을 계산합니다. 감독 학습 및 식별을 위해 MATLAB의 간단한 무작위 분할 알고리즘을 사용하여 추출된 피쳐 데이터를 별도의 교육 및 테스트 집합 폴더로 임의로 분할합니다.
추가 교육 파일을 열고 14줄을 편집하여 교육 세트 폴더를 지정하고, 16줄은 숙련된 분류기를 저장하기 위한 폴더를 지정하고, 17줄은 분류자의 파일 이름을 설정합니다. 그런 다음 코드를 실행합니다. 교육 세트의 선택한 기능을 사용하여 코드는 K가장 가까운 이웃 알고리즘으로 분류를 학습하고 분류기를 지정된 폴더에 저장합니다.
다음으로, 추가 테스트 파일 3을 열고 14~15줄을 편집하여 숙련된 분류기를 테스트하고 17번 선을 지정하여 학습된 테스트 세트를 지정합니다. 그런 다음 코드를 실행합니다. 분류기는 시험 세트에서 개별 림프구의 세포 유형을 식별합니다.
여기서 대표적인 3D 렌더링 굴절률 b 림프구, CD4 양성 T 림프구, 및 CD8 양성 T 림프구는 서로 다른 색 구성표를 가지며, 이미징 소프트웨어를 통해 할당된 굴절률 값에 따라 할당된 것으로 나타났다. 굴절률 값으로부터 정량적 형태학적 및 생화학적 특징을 계산할 수 있다. 본 실험에서 T와 B 림프구 분류의 정확도는 각각 93.15%와 89.81%였다.
CD4 양성 및 CD8 양성 T 림프구는 통계적으로 분류되었으며, 정확도는 각각 87.41%와 84.38%였다. 마지막으로, 다류, 세포형 분류자의 정확도는 각각 80.65%와 75.93%였다. 이미지의 품질과 수는이 기술의 성공에 필수적이다.
이미지 품질이 향상되고 데이터 볼륨이 높을수록 식별 정확도가 높아진다. 딥 러닝은 토모그램의 복잡한 데이터를 보다 완벽하게 분석하여 식별 성능을 향상시키는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 형광 및 3D 정량상 이미징은 확인된 림프구의 생리적 역할의 경로를 조사하는 데 사용될 수 있다.
개발 후이 기술은 세포 생물학 및 생물 의학 분야의 연구자들이 다른 유기체 내에서 관심있는 특정 질병을 탐구할 수있는 길을 열었습니다. 실제로, 특히 면역학자는 관심있는 인구를 확인하기 위해이 새로운 기술을 사용하여 혜택을 누릴 수 있습니다.
