MUB40 est un nouveau marqueur neutrophile, qui se lie à la lactoferrine et permet une détection spécifique chez l’homme et tous les échantillons de tissus mammifères testés jusqu’à présent. L’étiquetage des neutrophiles avec MUB40 est facile, rapide et spécifique. Il est maintenant largement utilisé dans notre laboratoire et l’implication de cette technique s’étendent vers le diagnostic des maladies inflammatoires.
Pour commencer, préparez des solutions une, deux et trois selon le protocole du texte, et placez-les dans une armoire anoxique pendant la nuit. Ensuite, centrifugeuse les tubes de sang recueilli à 650 g pendant 20 minutes pour séparer les cellules de la fraction plasmatique. Sans perturber le sang séparé, transférer les tubes à l’armoire anoxique et transférer les fractions plasmatiques dans un tube conique de 50 millilitres.
Après cela, retirez le tube de plasma de l’armoire anoxique et centrifugez-le à 2900 g pendant 20 minutes. En prenant soin de ne pas perturber les plaquettes granulées, transférer le tube à l’armoire anoxique et pipette le plasma plaquette pauvres dans un tube frais de 50 millilitres. À l’aide des tubes de collecte de sang, mélanger les globules rouges dans un tube conique de 50 millilitres.
Ensuite, ajoutez 0,9 % de chlorure de sodium jusqu’à ce que le volume total atteigne 44 millilitres et ajoutez six millilitres de 6 % dextran. Inverser le tube de 10 à 20 fois pour mélanger délicatement le mélange de sang et de dextran, et laisser le tube sédimenter pendant au moins 30 minutes. Pendant que le tube sédimente, préparer un gradient percoll en ajoutant 4,2 millilitres de solution Percoll à 5,8 millilitres de plasma, et inverser le tube pour mélanger.
Ensuite, recueillir le neutrophile contenant la fraction supérieure du dextran, en prenant soin de ne pas pipette globules rouges. Serrez le bouchon de vis, retirez le tube de dextran de l’armoire anoxique et centrifugez le tube à 300 g pendant 10 minutes. En prenant soin de ne pas déranger les cellules granulées, placez le tube dans l’armoire anoxique.
Ensuite, retirez le liquide par pipetting. Resuspendez doucement la pastille en un millilitre de plasma. Ajoutez lentement les cellules résuspendus au sommet de la solution Percoll.
Retirez soigneusement le tube de solution Percoll de l’armoire anoxique et centrifugez-le à 800 g pendant 20 minutes pour séparer les PBMC des neutrophiles. Ensuite, préparez 14 millilitres de solution tampon de lavage selon le protocole de texte. Ensuite, placez le tube Percoll dans l’armoire anoxique.
Utilisez une pipette pour enlever le Percoll et les PBMCs et résuspendez le neutrophile contenant des granulés dans un millilitre de solution tampon de lavage. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de perles magnétiques aux cellules résuspendues. Mélanger et incuber délicatement les cellules et les perles pendant au moins 15 minutes.
Après cela, laver une colonne de séparation deux fois, avec deux millilitres de tampon de lavage. Tout en tenant un nouveau tube conique de 15 millilitres sous la colonne, pipette lentement le mélange de globules rouges neutrophiles à travers la colonne. Le flux de la colonne doit être nuageux et perdre sa couleur rouge, confirmant la séparation totale des neutrophiles des globules rouges restants.
Ajoutez deux millilitres de tampon de lavage au sommet de la colonne et recueillez le débit dans le même tube. À la fin de ce lavage, le débit doit être clair. Mélanger délicatement le tube de collecte pour s’assurer que les neutrophiles sont répartis uniformément.
Puis recueilli 10 microlitres de l’écoulement à partir du comptage cellulaire. Après cela, retirez le tube de neutrophile de l’armoire anoxique et centrifugez le tube à 300 g pendant 20 minutes. Remettre les neutrophiles sédimentés dans l’armoire anoxique et retirer le tampon de lavage par pipetting.
Ensuite, resuspendez la pastille dans le plasma. Ajouter un microlitre de RI-MUB40-Cy5 à un millilitre de RPMI-1640 moyen, sans phénol rouge, et mélanger via pipetting. Ensuite, ajoutez un microlitre de solution FMLP et pipette à mélanger.
Transférer le mélange dans un plat de microscopie à fond de verre. Ajouter ensuite un volume approprié de cellules purifiées au plat. Enfin, placez le plat dans un microscope fluorescent inversé et commencez l’acquisition d’images.
Dans ce protocole, MUB40 a été employé sur des cellules vivantes pour détecter la sécrétion de neutrophile sur la simulation avec FMLP. La dynamique de la libération de la teneur en granulés, y compris la lactoferrine, peut être visualisée au fil du temps, ici en magenta. MUB40 peut être en outre utilisé sur les neutrophiles fixes.
Ici, des perles fluorescentes phagocytisantes dans une série timed. Le contenu du granule neutrophile est étiqueté ici en bleu. Les neutrophiles ont montré peu ou pas de coloration cellulaire aux premiers moments et graduellement, l’étiquetage RI-MUB40 a augmenté au fil du temps, tant sur la membrane plasmatique que sur la surface des perles.
MUB40 peut également être utilisé sur les tissus inflammatoires fixes pour détecter les neutrophiles spécifiquement, comme le montrent les chiffres du texte. Nous décrivons ici la procédure de purification du neutrophile, appliquée régulièrement dans notre laboratoire. Toute autre méthode convient, l’étiquetage MUB40-Cy5 fonctionnera toujours.
Le neutrophile peut être spécifiquement étiqueté avec MUB40 après purification, ou directement dans les tissus enflammés des patients ou des modèles animaux. Plusieurs dérivés MUB40 ont été conçus pour élargir son utilisation. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à un chercheur dans le domaine de l’inflammation, afin d’explorer le recrutement et l’activation neutrophiles dans les maladies inflammatoires.
