Notre sonde et nos protocoles fret permettent la quantification rapide et sensible de l’activité libre et surface-liée de l’élastase et de la cathespin G dans les expectorations des patients présentant des maladies neutrophiles de voie aérienne. Ces méthodes, permettent d’explorer différents aspects de la pathophysiologie des protéases. Les mesures des lecteurs de plaques permettent de grands criblages.
La microscopie confocale visualise l’activité enzymatique avec une solution subcellulaire. Alors que la cytométrie de flux, permet le phénotypage unicellulaire et la quantification de l’activité de la protéase d’une manière personnalisée. Cette technique peut être étendue à différentes maladies des voies respiratoires telles que la mucoviscidose, la bronchectasie ou la MPOC.
Et il peut être adapté à différents bioéchantillons tels que le sang ou les alvéoles bronchiques lavash ou les échantillons de souris. Avant de commencer la procédure d’induction des expectorations, inspirez 200 microgrammes des antagonistes des récepteurs bêta 2 salbutamol. Ensuite, inspirez une solution hypertonique à 6% saline pendant 15 minutes à l’aide d’un nébuliseur.
Recueillir les expectorations expectorées dans une boîte de Pétri. Séparez les touffes de mucus de la salive dans une boîte de Petri à l’aide d’une pointe de pipette. Peser le mucus, puis ajouter quatre parties de volume par poids de 10% Sputolysine et PBS aux expectorations.
Incuber le mélange à température ambiante sur un agitateur à bascule pendant 15 minutes pour dissoudre le mucus. Éteindre la réaction en ajoutant un millilitre de PBS froid pour chaque millilitre de 10% sputolysine. Pipetter le mélange pour obtenir une solution homogène.
Filtrer le mélange à travers une passoire à cellules en nylon de 100 microns dans un tube de 50 millilitres. Répétez l’étape de filtration à travers une passoire de 40 microns, puis centrifugez pendant 10 minutes à 300 fois G à quatre degrés Celsius. Transférer le surnageant dans un tube frais et le stocker sur de la glace.
Remettre doucement en suspension la pastille cellulaire dans 500 microlitres de PBS froid et la placer sur de la glace. Décongelez les enzymes sur la glace et définissez une courbe standard enzymatique comme décrit dans le manuscrit du texte. Parallèlement à la préparation standard, diluer les échantillons d’expectorations dans un tampon d’activation.
Sur le lecteur de plaque, réglez la longueur d’onde d’excitation de la sonde NE FRET NEmo-1 à 354 nanomètres et la longueur d’onde d’émission à 400 nanomètres pour le donneur et à 490 nanomètres pour l’accepteur. Pour la sonde CG FRET, sSam a réglé la longueur d’onde d’excitation à 405 nanomètres et l’émission à 485 nanomètres pour le donneur et à 580 nanomètres pour l’accepteur. Ajoutez 40 microlitres d’échantillons, d’étalons ou d’ébauches dans les puits d’une plaque noire de 96 puits demi-surface et ajoutez le mélange maître.
Démarrez le lecteur de plaque et enregistrez l’augmentation du rapport donneur/accepteur toutes les 60 à 90 secondes pendant au moins 20 minutes, ou jusqu’à ce que l’augmentation du signal atteigne un plateau. Exportez les données et calculez le ratio donneur/accepteur en divisant le RFU donneur par le RFU accepteur pour chaque point temporel et échantillon. Calculez ensuite la moyenne du rapport donneur/accepteur et l’écart type.
Déterminer la pente dans la croissance linéaire du changement de rapport donneur/accepteur. Pour chaque mesure, remettez en suspension 30 000 cellules d’expectoration dans un volume de 50 microlitres de PBS dans un tube de 1,5 millilitre. Incuber les cellules des expectorations avec un inhibiteur spécifique comme témoin négatif et une enzyme appropriée comme témoin positif pendant 10 minutes à température ambiante.
Ajouter 50 microlitres de PBS contenant un rapporteur FRET et une tache nucléaire à chaque tube pour obtenir une concentration finale de 2 micromolaires. Incuber le mélange à température ambiante pendant 10 à 20 minutes. Éteindre la réaction en ajoutant 100 microlitres de PBS glacé et placer les échantillons sur de la glace.
Cytospin le mélange sur des lames de microscopie. Ensuite, séchez à l’air et fixez les cellules avec du méthanol 10% glacé pendant 10 minutes. Après fixation, sécher à l’air et monter l’échantillon avec un milieu de montage approprié.
Capturez les images à l’aide d’un microscope confocal. Imagez au moins 100 cellules par condition pour obtenir des statistiques concluantes. Ressusciter 1 million de cellules dans 100 microlitres de PBS dans un tube de fond rond en polystyrène FACS de cinq millilitres, et placer le tube sur de la glace.
Ajouter deux microlitres de bloc FC à chaque échantillon. Incuber ensuite les échantillons pendant cinq minutes à température ambiante. Ajouter des anticorps à chaque tube et incuber sur de la glace dans l’obscurité pendant 30 minutes.
Lavez les cellules avec deux millilitres de PBS froid et centrifugez à 300 fois G et quatre degrés Celsius. Enfin, ressusciter dans 200 microlitres de PBS. Divisez la suspension en deux tubes, 100 microlitres chacun et ajoutez cinq microlitres de coloration de viabilité cellulaire.
Ajouter un inhibiteur spécifique approprié du NSP au tube témoin négatif et incuber l’échantillon pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Ajoutez du PBS à l’échantillon et filtrez-le à travers un filtre de 40 microns dans un tube FACS propre. Ajouter le rapporteur à l’échantillon témoin négatif et vortex doucement.
Commencez à acquérir des cellules incubées avec cet inhibiteur spécifique et, si nécessaire, ajustez légèrement les portes ainsi que les tensions pmts de rapporteur. Pour enregistrer les changements dans le donneur pour accepter un rapport dû à l’activité de la protéase liée à la membrane, enregistrez 1000 neutrophiles de chaque tube, toutes les cinq à 10 minutes. Calculer le rapport fret en divisant le donneur par les valeurs de canal accepteur pour les échantillons mesurés sur les neutrophiles simples viables fermées.
Des images des neutrophiles pré-incubées avec 100 sivilestat micromolaires ou laissées non traitées avant l’addition du journaliste NEmo-2 sont montrées ici. Le signal nucléaire a été utilisé pour identifier les neutrophiles par leurs caractéristiques noyaux segmentés et le roi a été sélectionné manuellement. Le donateur pour accepter un rapport des neutrophiles de crachat a été tracé.
Chaque point représente la moyenne d’un retour sur investissement. La cytométrie de flux permet de discriminer et d’étudier les neutrophiles d’expectoration. La distribution de l’IFM à zéro et 10 minutes a été observée après l’ajout du déclarant.
Les valeurs moyennes de MFI de distributeur et d’accepteur pour 1000 neutrophiles de crachat ont été calculées. Le ratio D/A a atteint un plateau après une augmentation initiale. L’induction des expectorations des donneurs en bonne santé prend un peu de pratique avant la perfection.
N’oubliez pas de vous détendre et de respirer l’aérosol pendant 10 à 15 minutes avant l’expectoration. De plus, gardez toujours les cellules d’expectoration sur la glace et traitez-les dès que possible après l’expectoration. Nous avons constaté que l’activité liée à la surface de protéase se corrèle avec des dommages tôt de poumon chez les enfants et avec la sévérité de l’affection pulmonaire dans les patients adultes de CF.
Par conséquent, ensemble, ces méthodes permettent l’exploration des protéases en tant que biomarqueurs précoces de l’inflammation dans les maladies neutrophiles des voies respiratoires.
