Cette méthode est utile pour répondre à certaines questions clés dans le domaine de la recherche sur la photosynthèse, comme le sont les complexes thylakoïdes putatifs physiologiquement réels avec des composants énergétiquement connectés? Le principal avantage du gel vert et du protocole TCSPC décrit ici est qu’il est rapide et robuste. Les échantillons peuvent facilement être traités et analysés en une seule journée, ce qui rend les questions d’entreposage et de stabilité moins préoccupantes.
Bien que TCSPC puisse fournir un aperçu des systèmes photosynthétiques que nous avons étudiés ici, il peut également être appliqué à d’autres systèmes allant du produit chimique au physique et biologique tels que les études du mouvement moléculaire fluorescent dans les liquides, les cellules, ou les motifs nouveaux-structurels tels que les couches monomoléculaires et les liquides ioniques. Pour commencer cette procédure, préparez les solutions de stock nécessaires et les mini gels verts tels qu’ils sont décrits dans le protocole texte. Ensuite, obtenir de la glace et éteindre les lumières.
À l’aide d’un homogénéisateur dounce en verre, homogénéiser complètement les feuilles d’épinards dans environ un à deux millilitres de tampon TMK. Pour créer un simple dispositif de filtrage, coupez une tâche délicate essuyez-la en deux et pliez-la en quartiers. Retirez le piston d’une seringue, puis emballez l’effacement plié dans le fond de la seringue.
Pipette la feuille homogénéise au centre du filtre d’effacement des tâches, puis utilisez le piston pour passer l’homogénéité à travers le filtre et le recueillir dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre. Centrifugeuse l’homogénéisation à 5000 g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour pelleter le matériau insoluble, y compris les membranes thylakoid. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille en un millilitre de tampon TMK.
Pour extraire la chlorophylle de chaque échantillon, prenez un aliquot de 50 microlitres et transférez-la dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Ajouter 950 microlitres de méthanol, capuchon le tube, et mélanger en l’inversant plusieurs fois. Centrifugeuse à 10 000 g pendant 10 minutes pour granuler les protéines précipitées.
À l’aide des mesures de concentration de chlorophylle comme guide, retirez et jetez un peu de volume de chaque échantillon au besoin jusqu’à ce que chaque tube contienne la même quantité totale de chlorophylle. Centrifugeuse à 5000 g pendant 10 minutes pour re-pelleter les membranes thylaïdes. Retirer et jeter le supernatant, en prenant soin d’enlever tout le surnatant sans déranger la pastille.
Tout d’abord, décongeler un aliquot de TMK 30% solution de détergent glycérol. Inverser plusieurs fois pour mélanger et garder la solution sur la glace. Ajouter un volume approprié de la solution de détergent pour dissoudre la pastille et entraîner une concentration finale de chlorophylle d’un milligramme par millilitre.
Pipette de haut en bas à plusieurs reprises tout en prenant soin d’éviter de mousser dans l’échantillon. Ensuite, gardez l’échantillon sur la glace pour permettre aux échantillons de thylakoid de solubiliser. Une fois la solubilisation terminée, centrifugez l’échantillon à 10 000 g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour granuler le matériau insoluble, ce qui donne un surnatant vert foncé clair.
Après cela, chargez 15 microlitres de supernatant thylakoid solubilized directement sur chaque puits d’un gel indigène précédemment préparé de 1,5 millimètre. À l’aide du tampon de fonctionnement 1X, commencez à exécuter le gel vert indigène à 100 volts. Placez l’ensemble du réservoir de gel sur de la glace humide pendant toute la durée de la course afin d’atténuer le chauffage résistatif.
Lorsque le gel a fini de fonctionner, retirez-le de la cellule électrophoresis et rincez le tampon en cours d’exécution des plaques de gel avec de l’eau distillée. Retirer la plaque supérieure du gel, puis rincer le gel à l’eau distillée. Placez le gel, qui est encore sur la plaque de verre inférieure, sur la glace; lorsque le gel n’est pas utilisé, couvrez-le d’une pellicule plastique et gardez-le dans l’obscurité pour l’empêcher de se dessécher.
Ensuite, utilisez un scalpel pointu ou une lame de rasoir pour exciser chaque bande d’intérêt lorsqu’il est prêt à procéder à l’analyse tcspc. Assurez-vous que la bande excisée ne contient aucun matériau de bande contaminante. Pour chaque complexe analysé, utilisez un spectromètre fluorescent pour faire un spectre fluorescent à température ambiante entre 600 et 800 nanomètres.
Placez du ruban masquant à chaque extrémité des glissières et pliez-le plusieurs fois pour créer des espaceurs, ce qui permettra de tenir fermement les glissières ensemble sans comprimer l’espace entre les deux, puis prendre en sandwich la tranche de gel entre deux diapositives de microscopie en verre. Ajoutez une petite quantité d’eau à la tranche de gel au bord des glissières en verre pour créer une interface lisse qui réduira la diffusion du signal. Ensuite, serrez le sandwich au gel dans le chemin de faisceau de sorte que le faisceau frappe la tranche de gel à travers le bord ouvert des assiettes.
Pour chaque complexe, recueillir 10 000 points de données totaux à intervalles réguliers dans tout le spectre des émissions de fluorescence. Pour analyser les données d’un complexe donné, normalisez d’abord la hauteur maximale de chaque courbe de décomposition pour toutes les longueurs d’onde recueillies, puis la queue correspond à chaque courbe de décomposition au spectre de fluorescence à l’état stable du complexe tel que décrit dans le protocole de texte. Les résultats représentatifs de l’électrophoresis gel vert fournit un exemple d’un résultat idéal pour l’analyse des thylakoids épinards, où un certain nombre de bandes claires et nettes vert sont visibles.
Les voies 2 et 3 présentent des résultats plus typiques de l’isolement thylakoid simple et de l’électrophoresis sur un gel non-gradient de 5%acrylamide. Les voies 4, 5 et 6 fournissent un exemple de mauvais résultats dus à des degrés croissants de sous-solubilisation de l’échantillon de thylakoid, tandis que la voie 7 démontre les résultats qui peuvent être obtenus quand arabidopsis thylakoids sont utilisés au lieu des épinards. Une fois que les courbes de données des données TCSPC ont été définies dans le même registre de temps, elles peuvent être normalisées à la même hauteur de pointe, ce qui permet de comparer les courbes comme une première analyse des données.
Les courbes de décomposition normalisées par pic de différents complexes peuvent ensuite être superposées les unes aux autres à une longueur d’onde donnée, ce qui permet de visualiser les différences de comportement entre les complexes. La queue correspondant aux courbes de décomposition permet la construction de spectres associés à la décomposition. Comme on le voit ici, les spectres associés à la désintégration pour le LHCII sont remarquables par le manque de caractéristiques dynamiques et la forme du spectre de fluorescence LHCII reste la même que les désintégrations du signal au fil du temps.
La désintégration du spectre de fluorescence est également retardée, nécessitant 100 picosecondes pour atteindre la fluorescence maximale. Ceci suggère que l’énergie n’est pas transférée entre les pigments énergiquement distincts dans le complexe pendant que la fluorescence se décompose. Les spectres associés à la décomposition sont ensuite construits pour le complexe de la bande 5.
Par rapport au LHCII, la fluorescence de la bande 5 se décompose beaucoup plus rapidement, atteignant l’intensité maximale en seulement 30 picosecondes, puis se désintégrer à moins de 20% de l’intensité initiale après 500 picosecondes. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que l’interprétation des données tcspc s’appuiera sur des informations biochimiques supplémentaires identifiant les composants des complexes à l’étude, par exemple, par 2 DSDS-PAGE et Western Blotting ou spectrométrie de masse.
