Soutien financier pour la plupart des études ont été fournies par le Conseil suédois de la recherche médicale (subvention 5942).

1. Animaux <ol><li> Les petits rongeurs comme les rats, souris et porcs Guinée, ont été utilisés comme des modèles animaux. Malheureusement, les souris adultes (de nombreuses souches de souris ont été évalués) ont tendance à manquer ou qui n&#39;ont qu&#39;un très faible nombre de potentiels-parent microvaisseaux (à partir de laquelle l&#39;angiogenèse peuvent provenir) au sein de leurs fenêtres mésentériques, ce qui rend les études utilisant des souris non fiables. Par conséquent, le dosage a été développé principalement pour les rats. </li><li> Les rats, qui sont acclimatés à un environnement standard d&#39;au moins 7 jours suivant la livraison de l&#39;éleveur, sont généralement logés par paires dans une cage standard sous un 12-hr cycle lumière / obscurité avec libre accès à l&#39;eau et de granulés. Chaque animal est marqué. Nous utilisons principalement des rats adultes jeunes (70-10 typiquement semaines d&#39;âge des différentes souches, mais en général des rats Sprague-Dawley; chez les rats jeunes que 5-6 semaines d&#39;âge, le nombre des microvaisseaux autochtones ont tendance à être faible) obtenu auprès d&#39;éleveurs diversifiés. Dans la période antérieure à l&#39;expérience et à travers l&#39;expérience, les animaux sont pesés tous les deux jours, et toujours sur le jour du sacrifice. Lorsque les animaux sont traités simultanément IP (pour l&#39;induction de l&#39;angiogenèse, voir ci-dessous) et SC ou IV ou PO, ils sont pesés chaque jour. Cela permet la création de groupes expérimentaux et de contrôle du poids du corps égale au début de l&#39;expérience, et permet la surveillance de l&#39;influence du traitement sur le poids corporel de gain au cours de l&#39;expérience. Depuis des rats mâles adultes croissance robuste physiologiquement (gagne environ 40-60 g par semaine selon le type de souche), le gain de poids de retard est un marqueur de substitution sensible de la toxicité, systémique bien-être, l&#39;anorexie, et un retard de croissance. </li></ol> Nous travaillons dans un établissement de haute qualité des soins aux animaux et des efforts considérables sont faits pour minimiser les niveaux de stress subi par les animaux. Les directives actuelles éthiques sont ceux établis par Workman P. et al. (Lignes directrices pour la protection et l&#39;utilisation des animaux dans la recherche contre le cancer. Br. J. Cancer 102, 1555-1577, 2010). Le Comité d&#39;éthique animale de l&#39;Université de Göteborg a approuvé ces études. 2. Pro-angiogéniques traitement par voie intrapéritonéale <ol><li> Le candidat pro-angiogéniques facteur à tester est dissoute et diluée dans l&#39;endotoxine saline utilisée pour la perfusion des patients (même à des niveaux extrêmement bas, l&#39;endotoxine est pro-angiogénique). Toutes les solutions sont constitués fraîchement sur le jour de l&#39;injection, une filtration stérile (Millipore 0,22 um-filtration), contrôlé pour un pH neutre (07/01 au 07/03), et utilisé à température ambiante. L&#39;agent de test est injecté à des concentrations faibles ou très faibles. Par exemple, le rat rVEGF 164 (564-RV/CF; R &amp; D Systems Europe, Ltd, Oxon, UK), qui est le VEGF-A prédominante isoforme chez le rat, est dilué à 96 pmol / ml dans une solution saline sans endotoxines, congelés et décongelés et un volume de 5 ml est injecté ip dans le rat. Nous utilisons une seringue de 5 ml avec 0,8 mm d&#39;aiguille (aiguille verte, 21G) pour injection ip. Ce traitement, administré deux fois par jour pendant 4,5 jours, soit., À partir de lundi matin (jour 0) au vendredi matin (jour 4), induit une réponse robuste angiogenèse germination dans les tissus de test mésentériques, avec un pic aux alentours de la Journée 21. Administrer l&#39;ip solution garantit que la totalité du volume est livré dans la cavité péritonéale (et non dans les intestins, la vessie ou de tout autre organe). L&#39;injection rapide de 5 ml permet de confirmer tactiles par l&#39;opérateur que le jet de fluide est passé à travers la paroi abdominale dans la cavité abdominale. Après, avant ou simultanément avec l&#39;ip pro-angiogéniques de traitement, tout agent de test de choix peuvent être administrés par voie systémique. </li></ol> 3. Administation systémique de l&#39;angiogenèse modulant agents <ol><li> Toute autre voie que la voie IP peut être utilisée, puisque le traitement IP peut affecter la réaction en cours angiogéniques par l&#39;induction de l&#39;inflammation ou éventuellement en activant les mastocytes dans les tissus d&#39;essai, qui peut conduire à une forte pro-angiogéniques de réponse. Outre l&#39;administration orale ou injection SC ou IV, nous utilisons souvent l&#39;administration SC en utilisant mini-pompes osmotiques (un ou plusieurs, avec des volumes variables et de pompage fois) pour fournir la solution à un taux constant jusqu&#39;à deux ou plusieurs semaines. </li><li> La perfusion continue sous-cutanée d&#39;agents de test Remplissage et l&#39;implantation de mini-pompes osmotiques Habituellement le jour 5, c&#39;est à dire, un jour après la fin du traitement VEGF IP, mini-pompes osmotiques (par exemple, le modèle 2ML2, avec un taux de pompage constant de 5,0 l / h pour les 14-15 jours; Alzet pompes osmotiques, Mountain View, CA , USA) sont remplies dans des conditions stériles avec l&#39;agent d&#39;essai ou le véhicule approprié. Après stockage dans stérile à 0,9% (p / v) de NaCl nuit à 37 ° C, la pompe (s) sont implantés chirurgicalement sc sur le dos (sur le côté de la moelle épinière Column dans la région des omoplates) de rats qui ont été anesthésiés à l&#39;aide de gaz isoflurane (EFP Isoba; Schering-Plough Santé Animale, Merck &amp; Co., Inc, Whitehouse Station, NJ, USA), d&#39;abord dans une chambre étanche transparent et puis par un masque (pour minimiser le stress causé à l&#39;animal suivant, la chambre est rincée avec de l&#39;air avant qu&#39;il soit réutilisé). L&#39;incision cutanée faite pour l&#39;implantation de la pompe est suturée immédiatement après l&#39;implantation à l&#39;aide du fil de soie. Depuis la prise de poids des animaux physiologiquement pendant la période expérimentale et les agents de test sont administrés à un taux constant, la dose réelle sélectionné pour un médicament à l&#39;essai par kg de poids corporel est plus élevé que la dose moyenne au début de la période de perfusion et est plus faible que la dose moyenne à la fin de la période de perfusion. La perfusion continue, tel que décrit ici, peut être considérée comme une forme étendue du traitement métronomique. </li></ol> 4. Fin à l&#39;expérience <ol><li> Un animal à la fois est placé dans une chambre hermétique transparente, ce qui est rincée avec gaz CO 2, qui tue rapidement les animaux. La chambre est rincée avec de l&#39;air avant d&#39;être réutilisés. </li></ol> 5. La récolte d&#39;échantillons tissulaires <ol><li> Comme indiqué dans le DVD, la paroi abdominale est ouverte et le mésentère petits-intestinale est identifiée, y compris la partie la plus distale qui atteint la valvule iléo-caecale (jonction de l&#39;intestin grêle et le gros intestin). Quatre (ou plus) de la plus distale située «fenêtres» sont numérotées et réparties sur une norme objective non traitée Superfrost Plus-lames (DAKO Denmark A / S, Glostrup, Danemark). Il est important d&#39;éviter, si possible, contaminant les échantillons de sang avec le contenu intestinal, ou d&#39;autres fluides corporels, comme ces matériaux peuvent être colorées de manière non spécifique, mais cela n&#39;invalide pas la visualisation ultérieure immunohistochimique des microvaisseaux. </li><li> Chaque spécimen fenêtre mésentérique avec le segment intestinal attachés petite est étalé sur une lame et séchées à température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, la souche intestinale est coupée, alors que les spécimens intacts mésentère membraneuses sont stockés à -20 ° C pendant des périodes prolongées. Ceci est illustré dans le DVD. </li></ol> Il convient de mentionner que la vascularisation des tissus et des brevets peuvent être visualisées avant la récolte avec transmise microscopie intravitale lumière. 6. Protocole pour la coloration immunohistochimique des microvaisseaux <ol><li> Jour 0 Les spécimens sont autorisés à dégeler de -20 ° C à la température ambiante, séché dans une armoire à 60 ° C pendant 1 heure, et conservés à température ambiante jusqu&#39;au lendemain. </li><li> Jour 1 Placer les lames dans la coloration détenteurs diapositive (dans chaque piste seconde) dans une cuvette et la laver deux fois avec du TBS (pH 7,8) pendant 10 minutes à température ambiante. La solution est jeté et remplacé par la solution suivante, et ainsi de suite pour toutes les étapes suivantes. </li><li> Traitement à la trypsine Remplir le bocal coloration qui va du port le support de diapositives coloration avec une solution de trypsine (25 ° C pendant 20 minutes). Jeter la solution et incuber à deux reprises avec une solution de saccharose à 2,5% (à température ambiante pendant 10 minutes chaque fois). Jeter la solution et rincer une couple de fois dans l&#39;eau distillée (à température ambiante pendant quelques minutes chacune). </li><li> Bloquant Remplir le bocal coloration qui va du port le support de diapositives coloration avec 0,5% de H 2 O 2 dans le méthanol (température ambiante pendant 30 minutes). Jeter la solution et rincer à l&#39;eau distillée (à température ambiante pendant quelques minutes). Jeter la solution et rincer deux fois avec du TBS (pH 7,4) (température ambiante pendant 8 minutes à chaque fois). </li><li> D&#39;incubation Toutes les incubations sont dans une chambre humidifiée à température ambiante. Environ 150 ul de chacune des solutions ci-dessous sont utilisées par diapositive. Les lames sont placées dans une chambre humidifiée et les solutions sont à la pipette sur les spécimens (les parties non-membraneuse n&#39;avez pas besoin d&#39;être couvert par les solutions). Pour chacune des étapes suivantes, soigneusement secouer toute la solution avant que la solution suivante est ajoutée. <ol><li> Incubation avec Normal (blocage) de sérum (de cheval) (kit ABC) 3 gouttes d&#39;une solution jaune / 10 ml de tampon de dilution pendant 20 minutes. </li><li> L&#39;incubation avec l&#39;anticorps primaire ARU0181, dont les étiquettes rat cellules endothéliales vasculaires. L&#39;anticorps est dilué 1:600 ​​avec un tampon de dilution (Biosource) (100 ul diluée 40 fois [congelés] ainsi que 900 ul de tampon de dilution) et l&#39;incubation a lieu durant la nuit à 4 ° C. </li></ol></li><li> Jour 2 Les lames sont retirés de la chambre humide, l&#39;anticorps primaire est jetée, et les lames sont placées dans un support de diapositives coloration, qui est immergée dans la cuvette et la rincer deux fois avec du TBS(PH 7,8) pendant 8 minutes. <ol><li> L&#39;incubation avec l&#39;anticorps biotinylé (ABC kit) Les lames sont placées horizontalement dans une chambre humidifiée et incubées avec 1 goutte de solution de bleu / 10 ml de tampon de dilution pendant 30 minutes. Jeter la solution et le lieu de la glisse dans un support de diapositives coloration immergé dans la cuvette et la rincer deux fois avec du TBS (pH 7,4) pendant 8 minutes. </li><li> L&#39;incubation avec le réactif ABC Les lames sont à nouveau placés horizontalement dans une chambre humidifiée et les solutions suivantes sont à la pipette sur la partie membraneuse des spécimens: 2 gouttes de solution d&#39;orange et 2 gouttes de solution brune SCT / 10 ml (pH 7,4) pendant 30 minutes. Mélanger soigneusement 30 minutes avant utilisation! Jeter la solution et le lieu de la glisse dans le support de diapositives dans la cuvette et la rincer deux fois avec du TBS (pH 7,4) pendant 8 minutes. </li></ol></li><li> Coloration avec DAB (0,05%) Cette étape doit être réalisée dans une hotte chimique aéré! Placer les lames et ajouter le 3,3-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich) solution à l&#39;aide d&#39;une pipette: solution de DAB 0,1% dans du TBS (pH 7,4) [congelés] est dilué 1:1 avec un mélange de 10 ul H 2 O 2 et 7,5 ml du SCT (pH 7,4). Cette solution est stérilisée par filtration juste avant utilisation (pour éliminer toutes les particules qui peuvent occulter l&#39;image microscopique). Colorer les spécimens pendant 8 minutes. Jeter la solution et le lieu de la glisse dans le support de diapositives coloration immergé dans la cuvette. Rincer sous l&#39;eau courante puis à l&#39;eau distillée pendant quelques minutes. </li><li> Déshydratation Les lames sont conservées dans le support de diapositives coloration. Rincez en défaussant et le remplissage du bocal contenant l&#39;eau distillée coloration / éthanol: eau distillée, alcool à 70%, 95% d&#39;alcool, l&#39;alcool absolu, avec 2 minutes de chaque solution. </li></ol> 7. Imagerie et l&#39;évaluation du réseau microvasculaire dans chaque échantillon de fenêtre mésentérique Après coloration immunohistochimique des cellules endothéliales vasculaires Comme le montre le film, les microvaisseaux sont visualisés au microscope in situ dans le tissu intact. <ol><li> Tout d&#39;abord, nous utilisons un microscope dessin avec plage de grossissement de 14 à 34 (Leica M Sauvage 3Z) au crayon sur du papier blanc de la zone de la fenêtre entière, ainsi que toute la zone vascularisée (VA) par la fenêtre mésentérique. VA, comme un pourcentage de toute la région, est facilement mesurée à l&#39;aide planimétrie informatisée ou non informatisé (ou tout simplement en découpant et la pondération de l&#39;image de toute la fenêtre, et les images de toutes ses parties vascularisé). </li><li> En utilisant une autre microscope à dessin, les profils individuels des microvaisseaux, qui sont facilement identifiables, sont dessinés à l&#39;encre noire sur papier blanc à 80 de grossissement dans les champs choisis au hasard. C&#39;est le point de départ pour l&#39;évaluation ultérieure morphométrique informatisée de la longueur de complications microvasculaires (MVL), qui est essentiellement une mesure de la densité microvasculaire. </li><li> En option, les variables liées à la formation de structures microvasculaires, ainsi que ceux pour l&#39;évaluation du nombre de germes microvasculaires et la longueur des pousses individuelles microvasculaires (n ° SP et Le. SP, respectivement) peuvent être déterminées. -Le contraste optimal entre les structures représentées bateau noir et le fond blanc facilite les analyses détaillées des images dans la plupart des commerciaux morphométriques des programmes informatisés. </li><li> Dans la plupart des cas, les principales variables sont VA et MVL, qui, lorsqu&#39;il est multiplié génèrent ensemble de la longueur totale microvasculaires (TMVL). </li></ol> 8. Analyse statistique Nous utilisons habituellement la norme non-paramétrique de Mann-Whitney U-test pour analyser non apparié (bilatéral) observations. Une moyenne de quatre fenêtres mésentérique par animal est utilisé comme point de données indépendantes pour chaque variable de la fenêtre mésentérique. Le critère de signification statistique est p ≤ 0,05.

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	<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+angiogenesis.">In vivo models of angiogenesis.</a> J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+testing+with+angiogenesis+models.">Drug testing with angiogenesis models.</a> Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).</li><li>Norrby, K., Jakobsson, A., Sorbo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast-cell-mediated+angiogenesis:+a+novel+experimental+model+using+the+rat+mesentery.">Mast-cell-mediated angiogenesis: a novel experimental model using the rat mesentery.</a> Virchows Arch. B Cell. Pathol. Incl. Mol. Pathol. 52, 195-206 (1986).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+and+angiogenesis.">Mast cells and angiogenesis.</a> APMIS. 110, 355-371 (2002).</li><li>Albertsson, P., Lennernas, B., Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+meteronomic+chemotherapy:+modulation+of+angiogenesis+mediated+by+VEGF-A.">On meteronomic chemotherapy: modulation of angiogenesis mediated by VEGF-A.</a> Acta Oncol. 45, 144-155 (2006).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+apo-lactoferrin+enhances+angiogenesis+mediated+by+vascular+endothelial+growth+factor+A+in+vivo.">Human apo-lactoferrin enhances angiogenesis mediated by vascular endothelial growth factor A in vivo.</a> J. Vasc. Res. 41, 293-304 (2004).</li><li>Norrby, K., Mattsby-Baltzer, I., Innocenti, M., &amp;amp, T. u. n. e. b. e. r. g., S, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orally+administered+bovine+lactoferrin+systemically+inhibits+VEGF(165)-mediated+angiogenesis+in+the+rat.">Orally administered bovine lactoferrin systemically inhibits VEGF(165)-mediated angiogenesis in the rat.</a> Int. J. Cancer. 91, 236-240 (2001).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-molecular-weight+heparins+and+angiogenesis.">Low-molecular-weight heparins and angiogenesis.</a> APMIS. 114, 79-102 (2006).</li><li>Norrby, K., Nordenhem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dalteparin,+a+low-molecular-weight+heparin,+promotes+angiogenesis+mediated+by+heparin-binding+VEGF-A+in+vivo.">Dalteparin, a low-molecular-weight heparin, promotes angiogenesis mediated by heparin-binding VEGF-A in vivo.</a> APMIS. 118, 949-957 (2010).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis.">Basic fibroblast growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res.. 48, 96-113 (1994).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis.">Vascular endothelial growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 51, 153-163 (1996).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+density+in+terms+of+number+and+length+of+microvessel+segments+per+unit+tissue+volume+in+mammalian+angiogenesis.">Microvascular density in terms of number and length of microvessel segments per unit tissue volume in mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 55, 43-53 (1998).</li></ol>

Le test a été introduit en 1986 3 et a successivement été développé et affiné dans notre laboratoire 7,10-12. Comme indiqué dans les articles de synthèse (invité) 1, 2, le test se compare bien à d&#39;autres mammifères dans le dosage angiogenèse in vivo à l&#39;égard en particulier aux fonctions importantes telles que le tissu de test adulte est nativement vascularisé et manque de l&#39;angiogenèse physiologique; un traumatisme minime, le cas échéant, est infligés au tissu; variables réellement quantitatifs sont mesurés, ce qui permet une analyse statistique sur la dose-réponse et moléculaire-activité des études; angiogenèse germination se produit, ce qui est prédominant dans les tissus normaux et de tumeurs, et les données de toxicité sont facilement accumulés chez les rats qui se développent vigoureusement physiologiquement à l&#39;âge adulte. Caractéristiques défavorables peuvent comprendre le fait que le test est relativement fastidieux, surtout lorsque l&#39;évaluation du nombre et la longueur des segments individuels et les choux de microvaisseaux microvaisseaux, qu&#39;il ne permet pas d&#39;observations real-time/serial, et qu&#39;il n&#39;est guère adaptée pour les souris Depuis de nombreuses fenêtres mésentérique chez la souris manque microvaisseaux parent potentiel à partir duquel de nouveaux capillaires peuvent provenir. Observations en temps réel sont, cependant, permis par microscopie intravitale où les fenêtres extériorisé mais intact mésentériques sont écrasés sur une platine de microscope tandis que l&#39;animal est anesthésié, tel que discuté dans 1. Des avancées significatives dans la recherche sur l&#39;angiogenèse ont été réalisés dans les dernières décennies en utilisant des modèles tels que la cornée micropocket, poussin chorioallantoïque membrane, et des dosages sc prise Matrigel, qui sont des outils utiles mais finalement limité. Les futures applications cliniques des thérapies anti-angiogéniques et pro-angiogéniques nécessiter l&#39;établissement et la validation des plus sensibles et biologiquement pertinent, réellement quantitatifs modèles pré-cliniques, telles que celle décrite dans le rapport actuel.

Tampons et réactifs 0,5 M solution stock de Tris-HCl (pH 7,8) Tris (hydroxyméthyl) aminomethan (60,57 g) est dissous dans ~ 900 ml d&#39;aqua dest et ~ 45 ml d&#39;HCl 25% (concentré) est ajouté pour atteindre un pH de 7,8 suivie d&#39;une dilution à 1 litre avec l&#39;eau distillée. Tampon Tris salin (TBS; pH 7,8) Pour 200 ml de la solution stock est ajouté 18 g de NaCl dissous dans dest ~ 1800 ml d&#39;aqua avec ajustement du pH à 7,8 à l&#39;aide de la solution mère, suivie d&#39;une dilution à 2 litres avec l&#39;eau distillée. SCT (pH 7,4) Pour 200 ml de la solution stock est ajouté 18 g de NaCl dissous dans dissous dans dest ~ 1800 ml d&#39;aqua avec ajustement du pH à 7,4 à l&#39;aide de la solution mère, suivie d&#39;une dilution à 2 litres avec l&#39;eau distillée. Solution de trypsine (0,05% de trypsine, 0,1% CaCl 2) Contient 0,1 g de trypsine et 0,2 g de CaCl2 dans 200 ml du SCT (pH 7,8). Solution de saccharose à 2,5% Contient 5 g de saccharose dans 200 ml du SCT (pH 7,8). Solution mère d&#39;azide de sodium à 1% dans du TBS (pH 7,4) Contient 1 g de Na-azide dans 100 ml avec le SCT (pH 7,4). Tampon de dilution: 0,1% de BSA, 0,01% de Na-azide (Utilisée pour diluer les anticorps dans le kit Vectastain ABC). Contient 0,1 g d&#39;albumine sérique bovine (BSA) et 1 ml de 1% de Na-azide, dilué à 100 ml avec le SCT (pH 7,4). ABC kit PK Vectastain 4002, ABC peroxydase IgG de souris Sérum de cheval normal; sérum de blocage; solution jaune: 3 drops/10 ml de tampon de dilution. Anticorps biotinylé; IgG anti-souris; solution bleue: 1 drop/10 tampon de dilution ml. ABC-réactif: la solution d&#39;orange, 2 gouttes, plus solution brune 2 ml drops/10 SCT (pH 7,4). Mélanger ces solutions 20 minutes avant utilisation! Souris (monoclonaux) anti-rat endothélium (Biosource International, Camarillo, Californie, USA) <table border="1"><tbody><tr><td> Catalogue # </td><td> ARU0181 </td></tr><tr><td> Clone # </td><td> MRC OX-43 </td></tr></tbody></table> Cet anticorps est dirigé contre toutes les cellules de l&#39;endothélium vasculaire chez le rat, à l&#39;exception de ceux dans le cerveau. Vectastain peroxydase avidine biotine (ABC) kit Le kit contient des anticorps primaires, anticorps secondaire biotinylé, complexe enzymatique avidine biotinylé (ABC), et le substrat enzymatique. Voir <a href="http://www.vectorlabs.com/">www.vectorlabs.com</a> ou <a href="http://www.immunkemi.se/">www.immunkemi.se</a> pour les protocoles. Albumine sérique bovine (BSA) (Sigma-Aldrich, catalogue # A-4503). DAB = 3,3 &#39;-diaminobenzidine ISOPAC (Sigma-Aldrich, catalogue # D 9015). La trypsine du pancréas de bovin (Sigma-Aldrich, catalogue # T 4665). Peroxydase Vectastain ABC-kit, la souris IgG (Immunkemi F &amp; D AB, Järfälla, Suède)

rat mesentery angiogenesis assay

Le mésentère de rat adulte angiogenèse fenêtre de dosage est biologiquement appropriée et est exceptionnellement bien adapté à l&#39;étude de l&#39;angiogenèse in vivo [voir les articles de synthèse], qui est la forme dominante de l&#39;angiogenèse dans les tumeurs humaines et non-tumorale des tissus, comme nous le verrons dans l&#39;examen des invités les documents 1,2. L&#39;angiogenèse induite dans les parties membraneuses mésentérique par voie intrapéritonéale (IP) d&#39;injection d&#39;un facteur pro-angiogénique peut être modulée par voie sous-cutanée (sc), par voie intraveineuse (IV) ou orale (po) le traitement avec des agents modificateurs de choix. Chaque partie membraneuse du mésentère est translucide et encadrées par du tissu adipeux, ce qui lui donne une apparence de la fenêtre ressemblant. Le test a les caractéristiques avantageuses suivantes: (i) le tissu test est nativement vascularisé, quoique faiblement, et depuis il est extrêmement mince, le réseau de microvaisseaux est pratiquement en deux dimensions, ce qui permet à l&#39;ensemble du réseau pour être évalué au microscope in situ; ( ii) chez des rats adultes le tissu test manque significative l&#39;angiogenèse physiologique, qui caractérise la plupart des adultes normaux des tissus de mammifères, le degré de vascularisation native est, cependant, en corrélation avec l&#39;âge, tel que discuté dans 1; (iii) le niveau négligeable de l&#39;angiogenèse induite par un traumatisme assure une sensibilité élevée, (iv) le dosage reproduit la situation clinique, selon le test de médicaments modulant l&#39;angiogenèse sont administrés par voie systémique et les réponses observées reflètent l&#39;effet net de toutes les voies métaboliques, cellulaires et moléculaires des altérations induites par le traitement, (v) le dosage permet d&#39;évaluations objectives, quantitatives, les variables sans biais de l&#39;extension spatiale microvasculaire, la densité et la formation de structures de réseau, ainsi que des capillaires germination, permettant ainsi des analyses statistiques robustes de la dose-effet et moléculaires relations structure-activité, et (vi ) le dosage révèle avec une grande sensibilité aux effets toxiques ou nocifs des traitements en termes de diminution du taux de physiologiques gain de poids corporel, comme des rats adultes une croissance vigoureuse. Mât-à médiation cellulaire angiogenèse a été démontrée en utilisant ce dosage 3,4. Le modèle démontre un haut niveau de discrimination quant à la posologie à effet et les effets mesurés de la systémique administré chimiquement ou fonctionnellement médicaments étroitement liés et les protéines, y compris: (i) à faible dose, administré metronomically chimiothérapeutiques standard de rendement diversifié, la drogue les effets spécifiques (ie, les activités de l&#39;angiogenèse suppressif, neutre ou angiogenèse stimulation 5), (ii) les risques naturels en fer-insaturés de la lactoferrine humaine, ce qui stimule le VEGF-A-médiée angiogenèse 6, et naturel de fer-insaturés lactoferrine bovine, qui inhibe le VEGF-A- angiogenèse médiation 7, et (iii) les fractions d&#39;héparine de faible poids moléculaire produite par des moyens divers 8,9. Par ailleurs, le dosage est très adapté à des études sur les effets combinés sur l&#39;angiogenèse d&#39;agents qui sont administrés par voie systémique de façon simultanée ou séquentielle. L&#39;idée de faire cette vidéo provient de la fin du Dr Judah Folkman quand il a visité notre laboratoire et témoin de la méthodologie d&#39;être démontrée. Examen des documents (invité) discuter et évaluer le dosage Norrby, K. Dans des modèles in vivo de l&#39;angiogenèse. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006). Norrby, K. Le dépistage des drogues avec des modèles de l&#39;angiogenèse. Expert Opin. Drogues. Découvert. 3, 533-549 (2008).

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Rat Mesentery Angiogenesis Assay

Adulte normale vascularisé tissus de mammifères qui manque de l&#39;angiogenèse physiologique et qui n&#39;a pas été exposé à une intervention chirurgicale est utilisée pour étudier: (i) l&#39;initiation et le développement de l&#39;angiogenèse après administration intrapéritonéale d&#39;agents de test, et (ii) la modification de l&#39;angiogenèse après l&#39;administration systémique de certains agents de test.

Assay Rat angiogenèse Mésentère

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

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Biology

13.8K vues.  University of Gothenburg. Adulte normale vascularisé tissus de mammifères qui manque de l'angiogenèse physiologique et qui n'a pas été exposé à une intervention chirurgicale est utilisée pour étudier: (i) l'initiation et le développement de l'angiogenèse après administration intrapéritonéale d'agents de test, et (ii) la modification de l'angiogenèse après l'administration systémique de certains agents de test.

Vidéo: Rat Mesentery Angiogenesis Assay

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes: un modèle in vitro pour l&#39;étude de l&#39;angiogenèse (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

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Biologie

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

Optimisé fibrine billes de gel d&#39;analyse pour l&#39;étude de l&#39;angiogenèse

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

Culture organotypique des cerveaux de rat E18

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Cartographie optique des coeurs de rats perfusés de Langendorff

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Culture primaire des adultes myocytes cœur de rat

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Extériorisation Mésentère Rat: Un modèle pour étudier la dynamique cellulaires impliqués dans l&#39;angiogenèse

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Des cellules endothéliales Tube Formation test pour la<em&gt; In Vitro</em&gt; Etude de l&#39;angiogenèse

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusion Technique chargé d&#39;enquêter sur le règlement des microvaisseaux perméabilité au Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

In Vivo Alkaline Comet Assay et Enzyme modifiée Alkaline Comet Assay pour mesurer Breaks brin d&#39; ADN et l&#39; ADN oxydative dommages de foie de rat

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.