Cette méthode aidera à comprendre et à effectuer les techniques de laboratoire nécessaires pour identifier l’activité de deux microARN dans les cellules cancéreuses du poumon in vitro. Le cancer du poumon est la principale cause de décès lié au cancer dans le monde. Ici, nous présentons des techniques allant des méthodologies de laboratoire de base aux protocoles plus complexes, tels que l’analyse de l’expression des gènes et le microARN protéique anticorps, spécifiquement utilisé pour identifier l’effet des actions de microARN.
Les méthodes suivantes nous aideront à répondre aux questions clés concernant l’effet de deux microARN, microARN 143 et microARN 506, sur la régulation du cycle cellulaire dans les cellules cancéreuses pulmonaires. Nous présentons différentes techniques de laboratoire, comme la transfection cellulaire, l’extraction de l’ARN, l’analyse quantitative en temps réel du PCR et du microARN. Nous espérons que notre présentation contribuera à la réalisation réussie de ces analyses.
Tout d’abord, placez les cellules d’culture dans un flacon approprié suffisant pour l’extraction de l’ARN et des protéines, pour effectuer l’expression des gènes à l’aide de qPCR ou d’analyse de micro-réseau. Puis incuber pendant la nuit avec des médias complétés par 10 pour cent FBS et 1 pour cent streptocotomycine pénicilline. Le lendemain, préparez l’échantillon de microARN à la transfection en diluant le microARN 143 et le microARN 506 dans les médias à une concentration de 100 nanomolaires chacun.
Sortez le flacon de l’incubateur et retirez les supports. Laver avec 1x PBS. Tous les contrôles non traités ne contiendront que des supports incomplets avec des cellules.
Incuber les cellules avec des supports de transfection pendant six heures dans un incubateur. Après six heures, retirez les supports et remplacez-les par quatre millilitres de supports frais et complets. Récolter les cellules après 24 heures et 48 heures par trypsinisation.
Ensuite, lavez-les deux fois avec 1x PBS dans chaque tube et retirez le surnatant. Afin d’effectuer l’extraction de l’ARN à un moment ultérieur, congeler les cellules à moins 80 degrés Celsius. L’extraction de l’ARN a été effectuée à l’aide d’un kit d’ARN, suivant les instructions du fabricant.
Tout d’abord, retirer les tubes de moins 80 degrés Celsius et laisser décongeler. Ajouter 300 microlitres de tampon de lyse et pipette de haut en bas pour briser la membrane cellulaire. Ajouter un volume égal d’éthanol 100 % ultra pur.
Ensuite, bien mélanger et placer dans la colonne séparée. Centrifugeuse et enlever le flux à travers. Ajouter 400 microlitres de lavage et de tampon et centrifugeuse pour enlever le tampon.
Ajouter 5 microlitres de DNAse 1 avec 75 microlitres tampon de digestion VNA dans chaque échantillon, et incuber pendant 15 minutes. Ensuite, lavez l’échantillon avec 400 microlitres tampon de préparation de l’ARN. Ensuite, lavez-les deux fois avec le tampon de lavage d’ARN.
Maintenant, ajoutez de l’eau sans nucléase à la colonne, centrifugeuse, puis recueillez l’ARN. Mesurer la concentration d’ARN. À ce stade, deux microgrammes d’échantillon d’ARN peuvent être envoyés pour le séquençage de l’ARN.
Préparer l’ADND selon le protocole décrit dans la section texte, à l’aide du thermocycleur. Préparez des solutions d’amorce avant et arrière avec de l’eau sans RNAse DNAse à une concentration de 10 micromolaires. Préparez un mélange maître pour que chaque gène soit détecté en fonction du nombre d’échantillons.
Pour chaque échantillon cDNA, la quantité de réaction est selon le tableau décrit dans le texte. Placez chaque échantillon dans leurs puits respectifs. Pour qPCR, il est toujours bon de préparer un document Excel avec 96 plaques de puits, afin de garder une trace des échantillons.
Pour chaque échantillon et gène analysé, effectuer leur réaction en triplicates, ou du moins en double. Sceller la plaque de plastique avec un scellant en plastique transparent et optiquement transparent. Évitez de toucher la fine couche de plastique avec les doigts, car cela peut produire un faux signal.
Faites tourner rapidement la plaque pour mélanger tous les reagents au fond de leurs puits. Ensuite, exécutez la plaque d’échantillon à l’aide d’une machine PCR quantitative en temps réel. Obtenez les valeurs CT générées par la machine qPCR et analysez l’expression relative des gènes.
Transfect les cellules comme décrit dans la section précédente de cette vidéo. Récoltez les cellules de chaque échantillon dans des tubes stériles séparés de 15 millilitres pour la trypsinisation. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec 1x PBS, par centrifugation à 751G pendant cinq minutes, puis retirez le supernatant.
Suspendez et brisez la palette en ajoutant 200 microlitres glacés 1x PBS à travers une pipette. Ajouter deux millilitres d’éthanol glacé à 70 pour cent, laisser tomber au tube, tout en vortexant doucement le tube pour fixer les cellules. Incuber les tubes pendant 30 minutes à température ambiante et les placer en quatre degrés Celsius pendant une heure.
Retirer les tubes de quatre degrés Celsius et de centrifugeuses. Ajouter 2 ml de PBS et vortex glacés, puis retirer le supernatant par centrifugation. Ajouter 500 microlitres de 1x PBS contenant de l’iodure de propidium et de la ribonuclease A avec une concentration de 50 et 200 microgrammes par millilitre, respectivement, dans chaque échantillon, et incuber pendant 30 minutes à température ambiante.
Transférez des échantillons dans des tubes appropriés, à l’protection de la lumière, et exécutez sur le cytomètre d’écoulement. Cette expérience est d’identifier l’expression de toutes les protéines de la voie du cycle cellulaire modifiées par le traitement par microARN. Recueillir des échantillons de protéines selon la procédure décrite dans la section transfection, et quantifier avec l’analyse BCA.
Retirez les glissières de moins quatre degrés Celsius une heure avant l’expérience pour amener à la température ambiante et pour éliminer l’humidité. Prenez 70 microgrammes d’échantillons de protéines et préparez des diapositives d’échantillons selon les instructions du fabricant, qui sont également décrites étape par étape dans la section texte. Ici pour noter, le lavage approprié des glissières avec de l’eau déionisée ultra-pure est une autre étape importante, car cela aidera à réduire l’arrière-plan des diapositives.
En outre, il est très essentiel dans cette expérience de ne pas assécher les diapositives de l’échantillon jusqu’à l’étape finale. Enfin, numérisez la diapositive à l’aide d’une machine à micro-tableau et analysez les données. L’analyse qPCR des échantillons traités par microARN a eu lieu pour déterminer l’expression génétique de CDK1, CDK4 et CDK6.
Ces gènes régulent le cycle cellulaire des cellules normales et cancéreuses, et ont été ciblés comme un moyen d’inhiber la progression tumorale. Les données ont démontré l’effet downregulatory de ces gènes dus au traitement avec le microARN 143 et 506. Les données de distribution de cycle cellulaire de la cytométrie de flux ont démontré une augmentation de population dans la phase G0 et G1, et une diminution de population dans la phase de S due à l’effet du traitement combinatorial du microARN 143 et 506.
L’analyse spécifique du micro-tableau du cycle cellulaire a détecté des changements d’expression des protéines d’environ 60 gènes. La carte thermique représentée indiquait une downregulation au niveau protéique de plusieurs gènes nécessaires à la progression du cycle cellulaire et à la prolifération, tels que CDK2, Helen 1 et 3, RE2F1. En revanche, les protéines couramment reconnues par leur effet inhibiteur cultivé ont été régulées.
Bien que les résultats soient semi-quantitatifs et qu’une analyse plus approfondie soit nécessaire, l’analyse des micro-réseaux donne un aperçu rapide de l’activité de la voie. Nous croyons qu’après avoir regardé cette vidéo, vous serez en mesure d’effectuer des expérimentations fondamentales, ainsi complexes, en laboratoire qui vous aideront à identifier l’activité microARN dans les cellules.
