Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la mécanobiologie, telles que la façon dont les forces sont transmises et détectées dans les cellules ainsi qu’entre les cellules et leur environnement. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’accès à l’information à l’échelle moléculaire sur la façon dont les protéines réagissent aux forces mécaniques à l’intérieur du contexte natif de la cellule vivante. Bien que cette méthode ait été appliquée spécifiquement à l’étude de la protéine d’adhérence focale vinculine, elle peut également être appliquée à d’autres protéines mécaniquement sensibles, telles que le talin, les cadhérines ou la nésprine.
La démonstration visuelle de cette méthode est critique, car la configuration appropriée d’imagerie est difficile mais nécessaire pour le succès de l’analyse. Commencez cette procédure avec l’expression stable de la construction du capteur de tension dans le type de cellule désiré, tel que détaillé dans le protocole de texte. Pour préparer les substrats pour l’ensemencement cellulaire, achetez quatre plats à fond de verre de 35 millimètres.
Travailler dans une hotte de culture cellulaire, dans un tube conique de 15 millilitres, faire quatre millilitres de 10 microgrammes par fibronectine millilitre dans stérile phosphate tamponné solution saline, ou PBS. Inverser doucement le tube une fois pour mélanger et laisser reposer la solution pendant cinq minutes dans le capot de culture cellulaire. Puis pipette un millilitre de solution de fibronectine sur chaque plat à fond de verre.
Laissez la solution fibronectine sur la vaisselle pendant une heure à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, aspirez la solution fibronectine et rincez une fois avec PBS. Laissez un millilitre de PBS sur la vaisselle jusqu’à ce que les cellules soient prêtes pour l’ensemencement.
Après avoir compté les cellules, ensemencer 30 000 cellules sur chaque plat en verre enduit de fibronectine avec le média complet approprié pour un volume final de 1,5 millilitres. Laisser les cellules se propager pendant quatre heures après l’ensemencement. À deux heures de propagation, aspirer le média de croissance et rincer une fois avec un média d’imagerie.
Laissez 1,5 millilitres du média d’imagerie. Réchauffez le microscope tel que décrit dans le protocole texte avant de commencer l’étalonnage. Pour calibrer le laser FRAP, ouvrez d’abord la fenêtre de configuration laser.
Réglez le réglage de l’éclairage aux paramètres d’éclairage FRAP appropriés pour l’exposition au laser à l’échantillon. Réglez ensuite le réglage de l’éclairage aux paramètres d’éclairage appropriés pour l’imagerie uniquement le fluorophore accepteur. Sélectionnez l’objectif de calibrer sous le réglage du système Coordinate.
Décochez manuellement cliquez sur les points d’étalonnage et vérifiez les images d’affichage pendant l’étalonnage. Réglez le temps de habit à 10 000 microsecondes et le nombre d’impulsions à 100. Placez maintenant la glissière d’étalonnage, faite de bromure d’éthidium scellée entre une glissière de verre et un glissement de couverture, dans l’adaptateur de scène avec le côté de glissement de couverture vers le bas.
Utilisez les paramètres d’éclairage de l’accepteur pour vous concentrer sur la surface de la glissière, identifiable comme le plan focal avec le signal le plus lumineux. De petits défauts dans le revêtement seront visibles pour faciliter la mise au point. Déplacez la glissière vers une zone avec fluorescence uniforme à travers le plan d’imagerie.
Cliquez sur Créer le paramètre pour le premier réglage d’étalonnage ou de mise à jour pour les étalonnages ultérieurs. Le logiciel initialisera le processus d’étalonnage, blanchissant et détectant automatiquement la position du point blanchi. Assurer un étalonnage réussi en évaluant l’image finale, qui sera une grille de trois points blanchis par trois qui devraient être répartis uniformément et au point.
Enregistrez l’image d’étalonnage pour une référence future. Retirez la glissière d’étalonnage et rangez-la en toute sécurité. L’étalonnage doit être effectué avant de commencer chaque expérience, mais n’a pas besoin d’être effectué entre les échantillons.
Préparez la configuration de la microscopie pour l’imagerie cellulaire en direct, de préférence avec un stade chauffé et objectif, ainsi qu’un contrôle du dioxyde de carbone. Laisser équilibrer pendant 20 minutes. Placez maintenant l’un des échantillons générés de cellules exprimant le capteur de tension dans le support du microscope pour l’imagerie.
Laisser les cellules s’équilibrer pendant 10 minutes. Pour assurer la santé des cellules imageées, maintenez la température à 37 degrés Celsius dans la chambre d’imagerie. Utilisez une pompe périssaltique pour passer humidifié 5% de dioxyde de carbone sur les échantillons à 15 millilitres par minute pour maintenir le pH.
Ouvrez l’outil d’acquisition multidimensionnelle, ou MDA, et installez-le avec les paramètres d’imagerie FRET, y compris les différents ensembles de filtres. Enregistrez ce MDA dans le dossier expérimental avec le nom de MDA_FRET_date. Configurez un autre MDA avec les paramètres d’imagerie FRAP, y compris les différents ensembles de filtres, les paramètres Timelapse et le Journal pour pulser le laser après l’acquisition avant l’eau de Javel.
Enregistrez ce MDA dans le dossier expérimental avec le nom de MDA_FRAP_date. Dans la barre d’outils en haut de l’écran, sélectionnez Journal, Démarrer l’enregistrement. Ouvrez la fenêtre MDA, chargez l’MDA_FRET_date et appuyez sur Acquérir.
Chargez ensuite l’MDA_FRAP_date et appuyez sur Acquérir. À la fin de l’acquisition, dans la barre d’outils en haut de l’écran, sélectionnez Journal, Stop Recording. Enregistrez ce journal dans le dossier expérimental avec le nom de FRETFRAP_date l’ajouter à une barre d’outils pour un accès facile.
Fermez la fenêtre MDA. Naviguez dans l’échantillon à l’aide de l’acquisition d’image sous Acquire, Acquire avec un temps d’exposition minimal et un filtre de densité neutre pour identifier les cellules d’intérêt. Réglez l’autofocus continu en naviguant vers les périphériques, Focus.
Concentrez-vous manuellement sur l’échantillon jusqu’à atteindre le plan d’imagerie correct. Cliquez sur Définir la mise au point continue et attendre que le système s’ajuste. Une fois que le système s’ajuste, cliquez sur Démarrer la mise au point continue.
Ensuite, trouvez une cellule exprimant le capteur de tension avec une localisation claire à une structure d’intérêt et de casser une image. Dessinez une région rectangulaire d’intérêt, ou roi, pour mettre en évidence où blanchir. Stockez cet emplacement roi.
Maintenant, initialisez FRETFRAP_date journal, qui commencera l’acquisition d’images FRET, suivie de l’initialisation du timelapse FRAP. Répétez ces étapes jusqu’à ce que 10 à 15 ensembles d’images soient acquis. Ensuite, analysez les données FRET-FRAP telles que détaillées dans le protocole texte.
Voici des résultats représentatifs pour l’imagerie FRET du capteur de tension vinculine, après segmentation et masquage pour isoler les adhérences focales. La variation spaciale de la charge de vinculine peut être vue à travers la cellule. L’imagerie et l’analyse frap peuvent être affectées par la stabilité de l’adhérence focale.
Une adhérence focale qui se translocalise rapidement pendant la période d’imagerie peut être difficile à suivre avec précision. Souvent, cela est indiqué par une courbe FRAP qui contient des discontinuités et dans ininterprétable. Pour une vinculine de type sauvage, il existe une corrélation inverse entre la charge protéique et le taux de rotation, ce qui indique que la vinculine est stabilisée par la force.
L’introduction d’une mutation dans la vinculine pour effectuer sa liaison au talin entraîne un renversement de la corrélation, ce qui indique que la vinculine incapable de lier le talin est déstabilisée par la force. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de préparer des échantillons correctement, de s’assurer que les cellules expriment le capteur aux niveaux endogènes et choisissent soigneusement les paramètres d’imagerie. Après cette procédure, d’autres méthodes comme l’immunofluorescence, la mesure de la dynamique de l’échelle cellulaire ou des cellules difficiles avec divers inhibiteurs peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires comme la façon dont la protéine d’intérêt interagit avec d’autres composants subcellulaires pour coordonner la réponse à la force.
