Cette méthode peut être utilisée pour asses comment de nouveaux agents thérapeutiques ou des stratégies, influencer ou augmenter la réponse cytotoxique des lymphocytes T pendant le cancer du pancréas. Cette technique permet aux tumeurs d’être rapidement digérées et stimulées in vitro, permettant l’analyse simultanée de plusieurs paramètres de la réponse des cellules T, qui peuvent être facilement adaptés pour d’autres applications. Pour commencer, utilisez des forceps, transférez la tumeur sur une boîte de Pétri.
Conserver cinq millilitres de milieu de digestion dans un tube de 50 millilitres sur la glace pour empêcher l’activité enzymatique de commencer. Prenez un petit aliquot de cette solution, pour couvrir la tumeur sur la boîte de Petri. Utilisez un scalpel stérile et des forceps pour couper la tumeur en petits morceaux, à peu près moins de trois millimètres de longueur.
Gratter les morceaux de tumeur dans le tube, et inverser doucement le tube jusqu’à ce que tous les morceaux sont immergés dans les supports de digestion. Transférer le tube sur un dispositif de secousse pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius pour digérer. Assurez-vous que tous les morceaux de tumeur sont submergés, et non collés au bord du tube.
Immédiatement après l’étape de digestion, placez le tube sur la glace pour ralentir l’activité enzymatique. Ajouter EDTA pour atteindre une concentration finale de 20 millimolaires, et vortex brièvement l’échantillon à mélanger afin de ralentir davantage l’activité enzymatique. Ouvrez le tube et rincez n’importe quel digest de tumeur du couvercle du tube avec le milieu frais de RPMI.
Ensuite, préparez une passoire de 70 microns, placez-la sur un tube ouvert de 50 millilitres sur la glace. Pré-mouiller le filtre avec moyen. Resuspendez les cellules digérées et lavez les côtés du tube à l’aide d’une stripette de 25 millilitres ou plus.
L’ouverture plus large de la Stripette permet au digest épais de passer facilement. Transférer tout le digest sur la passoire à l’aide de la Stripette de 25 millilitres. Écraser de haut en bas de la tumeur sur le dessus du filtre à l’aide d’un piston de seringue d’un millilitre.
Lavez continuellement les cellules à travers la passoire avec RPMI. Assurez-vous de laver avec suffisamment de force pour pousser les cellules à travers. Continuer le lavage jusqu’à ce que toutes les cellules soient passées à travers la passoire.
Centrifuger le tube pendant cinq minutes à 300 fois G, et quatre degrés Celsius. Resuspendez soigneusement la pastille cellulaire, et complétez rpmi, et passez directement par un autre filtre pour enlever n’importe quelle matrice extracellulaire, ou de grandes touffes de cellules qui ne peuvent pas être adéquatement résuspendées. Si aucune stimulation n’est nécessaire, tacher immédiatement les cellules isolées pour l’analyse de cytométrie de flux, ou les resuspendre dans le milieu de congélation de 10%DMSO et FBS, et stocker à moins 80 degrés Celsius.
Pour effectuer la stimulation, comptez d’abord les cellules. Diluer les cellules dans un milieu complet pour atteindre une concentration de deux fois dix à six pour 100 microlitres. Plaque 100 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque de puits à fond U 96.
Ajouter 100 microlitres de milieu complet, contenant une préparation 2X de PMA, et Ionomycine. Placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius, mais 5% de dioxyde de carbone pendant une heure. Puis, à 20 microlitres d’une préparation 10X de Brefeldin A, et Monensin, et les médias complets pour atteindre une concentration finale de 1,06 micromolaire, et 2,0 micromolaire, respectivement.
Remettre la plaque dans l’incubateur pendant encore quatre heures. Après avoir injecté 1000 cellules TB32048 dans le pancréas, les tumeurs orthotopiques prennent environ 30 jours pour se développer. Après digestion et stimulation des tumeurs orthotopiques récoltées, une fluorescence moins une a été exécutée pour déterminer la fluorescence de fond pour le gating.
Et Brefeldin A Monensin seul contrôle a été effectué pour déterminer la production basale de cytokines. Pour l’incubation d’interféron-gamma avec Brefeldin A et Monensin, n’a eu comme conséquence aucune augmentation du gamma d’interféron au-dessus du contrôle de FMO, dans la rate et les échantillons de tumeur. Cependant, l’addition de PMA et d’ionomycine, a augmenté le pourcentage de gamma intracellulaire d’interféron détectable dans les cellules T positives et CD8 positives de CD4 splenic et tumeur-dérivées.
Les lymphocytes T positifs CD4 et CD8 spléniques, utilisés comme contrôle positif, ont une production gamma d’interféron relativement plus élevée que les sous-ensembles de cellules T infiltrant les tumeurs. L’immunosuppression indique se produit dans la tumeur. Utilisant la même stratégie pour TNF alpha, un pourcentage élevé de lymphocytes T positifs CD4 spléniques étaient positifs pour l’alpha intracellulaire de TNF.
Comparé aux lymphocytes T positifs CD4 tumeur-infiltration. Les lymphocytes T positifs CD8 spléniques et tumoraux ont produit des niveaux similaires d’alpha TNF. Assurez-vous que la tumeur est suffisamment hachée, et que tous les morceaux sont immergés dans les supports de digestion.
Lors de la purée de la tumeur, assurez-vous d’être doux, et laver les cellules à travers bien. Le protocole de digestion tumorale peut être combiné avec le tri cellulaire assisté par flux, pour purifier les sous-ensembles individuels de cellules immunitaires pour une analyse supplémentaire, fonctionnelle ou d’expression génique. Nous avons utilisé cette méthode pour caractériser la façon dont les cellules B façonnent la réponse immunitaire pendant le cancer du pancréas, générant des tumeurs orthotopiques chez les souris à cellules B et les souris appauvries par cellules B.
