Cette méthode étend la nanotechnologie de l’ADN à partir des matériaux sources de l’oligonucléotide linéaire, DAS, dans un DAS plus circulaire. Les principaux avantages de ces techniques sont qu’il s’agit d’un simple, robuste et abordable pour la plupart des laboratoires. Pour la purification circulaire de l’ADN, ajouter 20 microlitres de formamide à une solution d’ADN circulaire fraîchement préparé et intact, à un volume final de 140 microlitres avec mélange.
Chargez 16 à 20 microlitres de solution circulaire d’ADN à chacun des sept à neuf puits de gel PAGE dénaturants. Mélanger deux microlitres de colorant de chargement avec huit microlitres de l’ADN linéaire précurseur correspondant, et injecter le mélange dans un puits de référence distinct. Ensuite, faire fonctionner le gel pendant environ deux heures à 10 volts par centimètre, arrêter la course lorsque le xylene cyanol FF peut être observé environ les deux tiers vers le bas du gel.
Portant des gants en caoutchouc et des lunettes, transférez le gel sur une plaque de chromatographie fluorescente à couche mince et utilisez une lame de rasoir pour couper les bandes de gel cible, comme l’ombrait l’irradiation UV. Placer les bandes de gel dans un tube de microcentrifugeuse de deux millilitres pour le séchage, puis écraser les gels séchés dans une pâte, et ajouter de l’eau déionisée à deux fois le volume de gel, pour la nuit secouant à température ambiante. Le lendemain matin, filtrer le mélange dans un tube de microcentrifugeuse de deux millilitres, en rinçant les côtés du premier tube avec un petit volume d’eau déionisée pour récupérer tout ADN résiduel, et en filtrant à nouveau pour combiner les supernés.
Puis purifier l’ADN circulaire par des précipitations d’éthanol, et stocker l’ADN à moins 20 degrés Celsius. Pour un annealing de pot, mélangez deux microlitres de tampon de magnésium d’acétate de Tris 10 fois, un microlitre de chaque solution de stock d’ADN de 10 micromolaires d’un ensemble de brins linéaires et circulaires dans des rapports molaires égaux, et le tampon supplémentaire de Tris EDTA dans un tube à essai PCR de 200 microlitres, à un volume final de 20 microlitres. Puis anneal la solution d’assemblage dans une bouteille thermique de 95 à 25 degrés Celsius, plus de 48 heures.
Pour un annealing en deux étapes de treillis infinis, mélangez deux microlitres de tampon de magnésium EDTA en acétate tris 10 fois, un microlitre de chaque solution de stock d’ADN de 10 micromilliards d’un ensemble de brins linéaires et circulaires dans des rapports molaires égaux, et un tampon Tris EDTA supplémentaire dans un tube à essai PCR de 200 microlitres, pour un volume final de 20 microlitres. Dans la première étape d’annealing de sous-tuile, anneal chaque solution de sous-tuile de précurseur dans un thermocycler de PCR, utilisant une méthode linéaire rapide de refroidissement de 95 à 25 degrés Celsius, plus de deux heures et demie. Pour préparer la solution d’assemblage, pour chacun des quatre treillis infinis, mélanger 10 microlitres de chacune des deux solutions de sous-tuiles correspondantes ensemble, à une concentration finale de 0,25 micromolaire pour chaque brin.
Dans la deuxième étape d’annealing de treillis, anneal le mélange de 20 microlitres dans un thermocycleur de PCR, utilisant une méthode de refroidissement lent. Pour deux étapes annealing de deux treillis rectangle fini, mélanger un microlitre de 10 fois Tris acétate EDTA tampon de magnésium, 0,5 microlitres de chaque solution de stock d’ADN de 10 micromilliards d’un ensemble de brins linéaires et circulaires dans des rapports molaires égaux, et tris tampon supplémentaire EDTA dans un tube à essai PCR de 200 microlitres, à un volume final de 10 microlitres. Dans la première étape d’annealing, anneal chaque solution de sous-tuile de précurseur dans le thermocycler de PCR, utilisant la méthode linéaire rapide de refroidissement, comme démontré, de 95 à 25 degrés Celsius, plus de deux heures et demie, et mélangent les solutions annealed 32 sous-tuiles, chacune avec 2 microlitres, ensemble dans un tube d’essai pcr de 200 microlitres, à un volume final de 64 microlitres.
Puis, dans la deuxième étape d’annealing, anneal le mélange de 64 microlitres dans le thermocycleur, utilisant la méthode de refroidissement lent, comme démontré. Pour la purification électrophoresis des treillis finis, préparez un gel agarose indigène de 2 % et chargez 20 microlitres de la solution de treillis fini dans chaque puits, ainsi que l’ajout de 5 microlitres d’une échelle d’ADN de 100 à 3 000 paires de base, dans un puits distinct. Après avoir fait fonctionner le gel pendant deux heures à 5 volts par centimètre dans un bain d’eau glacée, couper les bandes de gel cible à peu près au niveau du marqueur de paire de base de 1000 sous la lumière UV, comme démontré, et couper les bandes de gel en beaux morceaux.
Placez les gels concassés dans une colonne de filtre, et centrifugez la colonne pour extraire les treillis. Ensuite, recueillir la solution pour l’imagerie par microscopie de la force atomique. Pour la purification du treillis fini par polyéthalène glycol, ou PEG, mélanger 50 microlitres de la solution de treillis fini avec un volume égal de 15%PEG 8000 tampon, centrifugeuse de la solution, et de suspendre à nouveau la pastille dans 100 microlitres de tampon PEG, pour une centrifugation supplémentaire.
Après la deuxième centrifugation, suspendre à nouveau la pastille dans le tampon de magnésium EDTA en acétate tris, pour l’imagerie par microscopie de la force atomique. Pour l’imagerie infinie au microscope à force atomique en treillis 2D, fendez une nouvelle couche de mica et déposez deux microlitres de l’échantillon annelé sur la surface propre. Laissez les treillis d’ADN deux minutes absorber à la surface du mica, avant de laver la surface deux fois, avec 100 microlitres d’eau déionisée par lavage, en séchant la surface avec de l’air comprimé après le deuxième lavage.
Pour obtenir des images au microscope de force atomique des treillis infinis d’ADN dans l’air, ouvrez le mode de taraudage dans le logiciel d’imagerie, et réglez la taille de balayage à 0,5 à cinq micromètres, la résolution de balayage à 512 lignes, et le taux de balayage entre un et 3,5 Hertz. Ensuite, numérisez la surface du mica à l’aide de sondes triangulaires au microscope à force atomique. Pour l’imagerie finie de treillis d’ADN, coupez outre d’une couche fraîche de mica, comme démontré, et déposez 80 microlitres d’un tampon de magnésium d’acétate de Tris d’un pli sur la surface propre de mica.
Ensuite, ajoutez cinq microlitres d’échantillons finis dans le tampon, et laissez les treillis d’ADN deux minutes pour absorber à la surface du mica, avant d’ajouter 50 autres microlitres de tampon de magnésium d’acétate de Tris EDTA à la sonde. Ensuite, réglez la taille de l’analyse à 0,5 à un micromètre, la résolution de balayage à 256 lignes, et le taux de balayage à 1,5 Hertz, avant de scanner la surface avec les sondes triangulaires, comme démontré. L’ADN circulaire se déplace légèrement plus lentement que son ADN linéaire précurseur dans la PAGE de dénaturation, parce que le pore à l’intérieur de l’ADN circulaire est pénétré et retardé par les fibres de gel.
Les familles circulaires d’assemblage de 64 nucléotides n’ont qu’une seule bande claire et propre pour chaque assemblage, confirmant la stabilité de leurs motifs monomères. Les familles circulaires d’assemblage de 84 nucléotides de tuiles, cependant, ont des frottis autour de leurs bandes principales, indiquant la présence de sous-produits mineurs. Indépendamment de la mineure par les produits d’associés incorrects, d’excellents treillis avec des rendements élevés peuvent être assemblés à partir des motifs monomères cible.
Chaque assemblage a ses propres caractéristiques morphologiques à l’échelle des micromètres, telles que les nanofils, les nanotubes, les nanospiriens, les nanoribbones et les nanorectangles. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’éviter, en particulier, la contamination des débris pendant ou hors des étapes. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des recherches dans le domaine de la nanotechnologie de l’ADN pour explorer de nouveaux membres de la famille d’une nanotechnologie plus circulaire de l’ADN.
