Les auteurs tiennent à remercier S. Douglas pour des discussions et des conseils très précieux, et tous les membres du laboratoire Bachelet pour des discussions utiles et travail. Ce travail est soutenu par des subventions de la Faculté des sciences de la vie et de l&#39;Institut des nanotechnologies et matériaux avancés à l&#39;Université Bar-Ilan.

1. Préparation de Staples Piscine Mélange <ol><li> Ordre lyophilisé ADN nanorobots agrafes sur des plaques à 96 puits énumérés dans le tableau 1 (voir Matériaux) et de normaliser à 10 nmol. Pour une description détaillée de la conception et l&#39;architecture du nanorobot d&#39;ADN voir Ben-Ishay et al., 14 et Douglas et al. 15). </li><li> Reconstituer chaque agrafe bien avec DNase / ultrapure exempte de RNases à une concentration de 100 um. Pour agrafes normalisées à 10 nmol, reconstituer avec 100 pi d&#39;eau ultra-pure. </li><li> Piscine ensemble 20 pi de chaque agrafe à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux et 55 ml de solution stérile bassin. Remarque: Comme la forme de nanorobot se compose de 254 brins de base (y compris de base, arêtes, poignées et des séquences guides, tableau 1), la concentration de chacun des agrafes dans la piscine des agrafes est 394 nM. Retrait des agrafes de la piscine de base, ou l&#39;ajout de certains au vol différenteUMES, peut réduire considérablement le rendement, ou entraîner autrement dans les agrégats dépliées. </li></ol> 2. Préparation de Fabrication Réaction Mélange <ol><li> Pour un mélange de réaction standard utiliser 40 pl de l&#39;ADN simple brin M13mp18 du génome viral circulaire, correspondant à 4 pmol de l&#39;ADN de l&#39;échafaudage (solution 100 nM boursier, voir Matériaux). La concentration finale de échafaudage dans le mélange de fabrication est de 20 nM, volume final de 200 ul. <ol><li> Ajuster la quantité d&#39;ADN de l&#39;échafaudage en fonction des besoins spécifiques; cependant, maintenir la concentration finale de l&#39;ADN de l&#39;échafaudage dans le mélange de réaction à une 20 nM constante. </li></ol></li><li> Ajouter agrafes à atteindre un échafaudage à ratio des agrafes de 1 à 10, respectivement. Pour une concentration de 20 nM d&#39;ADN d&#39;échafaudage, chacun de concentration finale de 254 agrafes est de 200 nM. Pour un volume de réaction de 200 ul finale, on ajoutera 102 pi du mélange de la piscine des agrafes (section 1.2). <ol><li> Ajouter séquences Porte spécifiques séparément THe mélange réactionnel pliage pour le moment. Ces oligos sont commandés séparément et nécessitent une purification par HPLC. Assurez-vous que oligos Porte sont présents dans un rapport de 1:10 à échafaud Porte de séquence, soit 200 nM de chaque oligo pour une concentration de 20 nM de l&#39;échafaudage. Pour un pliage volume de réaction de 200 pi, 0,4 pi ajouter pour chacun des oligo quatre porte à une concentration stock 100 um. </li></ol></li><li> Ajouter 10x TAE de stock tampon pour atteindre une concentration finale de TAE 1X (40 mM Tris-acétate, EDTA 1 mM). Pour un pliage volume de réaction de 200 pi, ajouter 20 pi de 10x TAE. </li><li> Ajouter 1 M MgCl 2 à une concentration finale de 10 mM. Pour un pliage volume de réaction de 200 pi, ajouter 2 pi de 1 M MgCl2. </li><li> Ajouter 36 ul de DNase / RNase eau ultra-pure à une connexion atteindre un volume final de 200 ul. </li><li> Vortex et 100 ul aliquote des échantillons dans des fioles de PCR. Remarque: Consultez la spécification de cycleur thermique en ce qui concerne les volumes de réaction maximale à utiliser.Réduire le volume pour répondre à ces limites ne va pas réduire les rendements obtenus. Les volumes de réaction au-dessus du maximum spécifié mettra en péril les rendements. </li></ol> 3. Température recuit Rampe de Fabrication Réaction <ol><li> Programme cycleur thermique comme suit: <ol><li> Rampe 85 ° C à 60 ° C à une vitesse de 5 min / ° C. </li><li> Rampe de 60 ° C à 4 ° C à une vitesse de 75 min / ° C. </li><li> Tenir à 4 ° C indéfiniment. </li></ol></li><li> Après la fabrication est terminée, stocker les échantillons à -20 ° C. </li></ol> 4. Suppression de Staples excédentaires <ol><li> Ajouter 100 ul de mélange réactionnel de pliage à un filtre centrifuge 0,5 ml avec un MWCO de 100 kDa. Enregistrer un échantillon de 10 pi de nanorobots pré-purification pour une analyse ultérieure. </li><li> Centrifugeuse pendant 10 min à 9600 x g. </li><li> Ajouter 400 ul de tampon de pliage (1x TAE, 10 mM de MgCl2). </li><li> Répétez les étapes 4.2 et 4.3 fois plus. </li><li>Centrifugeuse pendant 5 min à 9600 x g. </li><li> Récupérer le concentré en plaçant le filtre à l&#39;envers dans un tube à centrifuger propre et essorage pendant 1 min à 9600 x g. Volumes finals peuvent varier en fonction du volume initial de mélange réactionnel de fabrication qui a été mis dans le filtre. Typiquement, un volume final 25-60 pi de l&#39;échantillon de nanorobot concentré est obtenu. </li><li> Mesurer la concentration de l&#39;ADN dans les échantillons par l&#39;intermédiaire d&#39;un spectrophotomètre à 260 nm. Utilisez poids moléculaire de 5,3 pg / pmol lors du calcul des concentrations molaires des échantillons de nanorobots. Remarque: Le coefficient d&#39;extinction molaire pour ADNdb, 50 pg / OD 260, est suffisant pour la plupart des applications. 48 pg / OD 260 prend en compte la thymine poly ssADN étend sur les bords des agrafes. </li></ol> 5. Agarose Gel d&#39;électrophorèse Analyse des Plié Nanorobots <ol><li> Préparation du 0,5 x TBE (45 mM de Tris-borate, 1 mM EDTA), gel d&#39;agarose à 2% additionné de 10 mM de MgCl2 </sub&gt; (adapté de Ernesto Castro et al 21.): <ol><li> Préparer tampon de TBE 0,5x en diluant 6,25 ml de 10x TBE tampon de stock en 118.75 ml de ddH 2 O. </li><li> Dissoudre 2,5 g d&#39;agarose dans 125 ml de tampon TBE 0,5x de. </li><li> Faire bouillir au micro-ondes jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose est complètement dissous. </li><li> Ajouter 1,25 ml de 1 M de MgCl2 à une concentration finale de 10 mM. </li><li> Ajouter 7 pi de 10 mg / ml de bromure d&#39;éthidium. </li><li> Attendez solution à refroidir légèrement et remplir le plateau de gel avant la solidification du gel d&#39;agarose. Installez peigne désiré immédiatement. </li><li> Préparer 1 L 0,5x TBE tampon fonctionnant par addition de 50 ml de 10x TBE du stock régulateur et 10 ml de 1 M MgCl 2 à 940 ml de ddH 2 O. </li><li> Une fois que le gel est add solide exécutant tampon à l&#39;appareil d&#39;électrophorèse et le dispositif mis dans un bain de glace. </li></ol></li><li> Charge 1 pg d&#39;ADN total de la nanorobots pré-purification (étape 3.2), et après purification (étape 4.7), aux côtés d&#39;un échafaudageÉchantillon d&#39;ADN et un ADN marqueur, sur le gel de 1 kb. Un exemple est donné sur la figure 2. Volumes d&#39;échantillons réels dépendent des concentrations obtenues après purification. Chacun des échantillons est chargé avec du tampon de chargement à un rapport de 1: 6 de volume final. </li><li> Réglez la source d&#39;alimentation à 80 V et exécuter gel pendant 3 heures. Exécutez le gel dans un bain rempli de glace et d&#39;eau. Nanorobots vont se dérouler et apparaissent comme un frottis si le gel d&#39;agarose réchauffe pendant l&#39;électrophorèse. Pendant électrophorèse ajouter de la glace supplémentaire pour garder appareil de chauffage. </li><li> Voir le gel sur une table UV (Figure 2). </li></ol> 6. coloration négative du nanorobot avec Uranyle-formate <ol><li> Préparation de la solution mère d&#39;uranyle-formate 2% (adapté de Castro et al 23.): <ol><li> Peser 100 mg de poudre d&#39;uranyle-formate dans un tube de 15 ml. </li><li> Faire bouillir DNase / RNase eau ultra-pure gratuite pendant 3 min à De-oxygéner. </li><li> Ajouter 5 ml d&#39;eau chaude désoxygéné (~ 60 ° C)dans le tube de 15 ml contenant de la poudre d&#39;uranyle-formate (de l&#39;étape précédente). Bien fermer le couvercle, envelopper dans du papier d&#39;aluminium et le vortex rigoureusement pendant 10 min (tube, fixez un vortex). Solution devrait apparaître trouble avec une couleur jaune. </li><li> Solution à travers un filtre de 0,2 um seringue fi filtre. Solution doit devenir clair. </li><li> Aliquoter 200 ul de la solution dans des tubes de microcentrifugation. </li><li> Centrifugeuse à vitesse max pendant 5 min dans une centrifugeuse de paillasse à des échantillons de la piscine au fond du tube. </li></ol></li><li> Chargement de l&#39;échantillon à grille et coloration négative: <ol><li> Décongeler une aliquote de 200 pi de solution uranyle-formate 2% (préparé dans la section 6.1). Ajouter 10 pi de solution et le vortex NaOH 0,5 M rigoureusement pendant 3 min. Centrifugeuse à vitesse max pendant 5 minutes à l&#39;aide d&#39;une centrifugeuse de dessus de table. </li><li> Pendant ce temps, la grille décharge luminescente en utilisant l&#39;air ambiant à 0,2 mbar et 25 mA pendant 30 sec. </li><li> Ajouter 15 pi de 2 nM échantillon de nanorobot après purification (sectisur 4,7) sur face supérieure de la grille (tenue avec une pince) et laisser absorber pendant 1 min. Utilisez du papier fi ltre pour drainer l&#39;excès de liquide en plaçant la grille sur le dessus du papier filtre. Ne touchez pas la surface de la grille. </li><li> Ajouter 10 ul de la formiate-uranyle à 2% (de l&#39;étape 6.2.1) sur la face supérieure de la grille (tenue avec des pinces). </li><li> Utiliser rapidement papier fi ltre pour drainer l&#39;excès de liquide en plaçant la grille sur le dessus du papier filtre. Ne touchez pas la surface de la grille. </li><li> Répétez les étapes 6.2.4 et 6.2.5. </li><li> Ajouter 10 ul de la formiate-uranyle à 2% (de l&#39;étape 6.2.1) sur la face supérieure de la grille (tenue avec des pinces). Laissez solution de coloration absorber pendant 30 sec. </li><li> Utilisez du papier fi ltre pour drainer l&#39;excès de liquide en plaçant la grille sur le dessus du papier filtre. Ne touchez pas la surface de la grille. </li><li> Laissez sécher complètement la grille pendant au moins 30 min, face vers le haut sur un papier filtre, avant de l&#39;injecter dans le TEM. </li></ol></li></ol>

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G., Praetorius, F., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+and+scalable+preparation+of+pure+and+dense+DNA+origami+solutions.">Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12735-12740 (2014).</li><li>Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+DNA-origami+nanostructures+by+rate-zonal+centrifugation.">Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation.</a> Nucleic Acids Res. 41 (2), (2012).</li><li>Bai, X. C., Martin, T. G., Scheres, S. H., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+3D+DNA-origami+object.">Cryo-EM structure of a 3D DNA-origami object.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20012-20017 (2012).</li></ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Nous avons décrit la fabrication, la purification, et la visualisation de la nanorobot d&#39;ADN. À la suite de la fabrication du châssis hexagonal du dispositif, la fonction de la nanorobot est programmé avec la simple introduction de marchandises spécifique et brins de détection pour le robot qui trouvent facilement leur position désignée en raison de la liaison hydrogène complémentarité avec des sites d&#39;accueil disponible simple brin 14 , 15,22. Le protocole de f...

Les utilisations pour les acides nucléiques nanotechnologies sont étonnants. La traçabilité de l&#39;appariement de bases de Watson-Crick ainsi que la facilité et à faible coût relatif de la synthèse à grande échelle d&#39;oligos-mesure 2 a généré une explosion des applications 3 et la recherche dans le domaine de la nanotechnologie de l&#39;ADN. Nanotechnologie d&#39;ADN structurale, sur la base de la jonction 4,5 Seeman immobile comme un bloc de construction fondamental se sert de l&#39;ADN en tant qu&#39;unité primaire auto-assemblage pour la construction de formes arbitraires 6-8. Le développement récent de l&#39;ADN origami échafaudage 9 technique permet la construction de 2D / 3D nano-architectures complexes 10-12 avec une précision sub-nanométrique et est une voie efficace pour la construction de nouveaux objets fonctionnels avec l&#39;augmentation de la complexité et de la diversité étonnante. Le processus de construction est basée sur un ADN simple brin long échafaudage, généralement dérivé d&#39;un génome virale, qui peut être pliée par l&#39;hybridation de centaines de courts oligonucleotides d&#39;ADN simple brin appelé agrafes. La résolution structurel élevé obtenu par cette technique est le résultat direct des dimensions naturelles de la double hélice d&#39;ADN, tandis que la reproductibilité de la fabrication est le résultat d&#39;adapter les courtes séquences de base simple brin pour faciliter la liaison hydrogène complémentarité maximale réalisable. Avec l&#39;utilisation d&#39;un recuit lent de la température de rampe la plus faible d&#39;énergie conçu, thermodynamiquement préféré nanostructure est atteinte avec des rendements élevés et de fidélité. La mise en œuvre facile des règles de conception de jonction dans un code informatique a permis le développement d&#39;outils de CAO, tels que caDNAno 13, qui simplifie extrêmement la tâche de concevoir de grandes structures complexes contenant des centaines de jonctions connectés. Auparavant, nous avons décrit la conception d&#39;un nanorobot d&#39;ADN à l&#39;aide de l&#39;outil 14,15 caDNAno. Ici, nous décrivons la fabrication etvisualisation, par microscopie électronique à transmission (MET), de l&#39;nanorobot, un nanodispositif hexagonale creuse 3D, avec des dimensions de 35 x 35 x 50 nm 3, conçu pour subir un changement conformationnel majeur en réponse à un stimuli prédéterminés et marchandises spécifiques présents, tels comme des protéines ou des oligonucléotides d&#39;acide nucléique, piégé à l&#39;intérieur. Bien que 12 stations de chargement sont disponibles à l&#39;intérieur du châssis creux, le nombre réel de cargaison lié est différente de la taille de la cargaison. Molécules cargo vont de petites molécules d&#39;ADN à des enzymes, des anticorps et des nanoparticules d&#39;or 5-10 nm. Cargocan être soit uniforme ou hétérogène, de telle sorte que chaque nanorobot contient un mélange de molécules différentes. Détection est réalisée par deux double hélice conception de portes de verrouillage pour détecter protéines, acides nucléiques ou d&#39;autres produits chimiques, basée soit sur ​​aptasensor 16,17 ou 18 brin d&#39;ADN déplacement technologies. Les développements récents dans les protocoles de sélection des aptamères 19-21 permettent la conception de nanorobots répondreà une gamme de plus en plus des molécules et des types de cellules. Des travaux antérieurs ont montré un nanorobot portant un anticorps spécifique, qui lors de la liaison à son antigène peut relayer soit un inhibiteur ou un signal prolifique à l&#39;intérieur de types de cellules spécifiques dans une population de cellules mixtes 15. Une caractéristique intéressante de ces nano est leur capacité à effectuer des tâches encore plus complexe et logique de commande avec l&#39;introduction de différents sous-types de nanorobots dans une seule population. Récemment, nous avons démontré sous-types spécifiques de nanorobots spectacle soit comme des régulateurs positifs ou négatifs, de contrôler une population effecteur contenant une molécule cargo actif 22. Le protocole présenté ici décrit la fabrication, la purification et l&#39;imagerie d&#39;un nanorobot fermée, avec des séquences de sonde de aptamère qui se lient sélectivement au PDGF pour faciliter l&#39;ouverture de la nanorobot 15,22. Le procédé de fabrication décrit est similaire au nprocessus de fabrication de anorobot initialement représenté par Douglas et al. 15 avec des changements visant à réduire la durée globale du processus, tout en augmentant les taux de rendement et de purification.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNase/RNase free distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13mp18 ssDNA scaffold</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N4040S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TAE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15558-042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter 100K MWCO</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC510024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3125</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide 10mg/ml solution&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 kb DNA marker</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3232S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Dye</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7021S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uranyl formate</td>
			<td>polysciences</td>
			<td>24762</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbon-coated TEM grids&#160;</td>
			<td>Science services</td>
			<td>EFCF400-Cu-50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler c1000 Touch</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow Discharge K100X</td>
			<td>Emitech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV table Gel Doc EZ Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM FEI-G12</td>
			<td>Tecnai</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

folding and characterization of a bio-responsive robot from dna origami

Le nanorobot d&#39;ADN est un dispositif nanométrique hexagonale creuse, destinée à ouvrir en réponse à des stimuli spécifiques et des marchandises présente séquestrés à l&#39;intérieur. Les deux stimuli et des marchandises peuvent être adaptés en fonction des besoins spécifiques. Ici, nous décrivons le protocole de fabrication ADN nanorobot, avec l&#39;utilisation de la technique de l&#39;ADN origami. La procédure lance en mélangeant courts agrafes d&#39;ADN simple brin dans un mélange d&#39;actions qui est ensuite ajouté à une longue, circulaire, simple brin d&#39;ADN échafaudage en présence d&#39;un tampon de pliage. Un cycleur thermique standard est programmé de manière à abaisser progressivement la température de réaction de mélange pour faciliter le recuit agrafes-à-échafaudage, qui est la force motrice derrière le pliage de la nanorobot. Une fois que la réaction de pliage 60 h est terminée, les agrafes en excès sont éliminées en utilisant un filtre centrifuge, suivie par la visualisation par l&#39;intermédiaire d&#39;une électrophorèse sur gel d&#39;agarose (AGE). Enfin, la fabrication réussie de la nanorobot est vérifiée par microscopie électronique à transmission (TEM),avec l&#39;utilisation d&#39;uranyle-formate comme coloration négative.

Les résultats représentatifs sont présentés sur la figure 2A. Toutes les voies contiennent 1 pg d&#39;ADN total, mesuré par spectrophotomètre (DO260). Par rapport à la circulaire échafaudage d&#39;ADN simple brin (Lane 2), nanorobots sont entravés dans le gel en raison de leur poids moléculaire élevé, le résultat d&#39;agrafes hybridation à l&#39;ADN de l&#39;échafaudage (Lane 3. flèche rouge). La bande basse de poids moléculaire Lane 3 représente agrafes ex...

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Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami | Chemistry | Video

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

Pliant et caractérisation d&#39;un Robot Bio-sensible de l&#39;ADN Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

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14.4K vues.  Bar-Ilan University. DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM). 

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Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two dimensional (2D) structures. These technologies are mature, offer high precision and many of them can be implemented in a high-throughput manner. We leverage the advantages of planar lithography and combine them with self-folding methods1-20 wherein physical forces derived from surface tension or residual stress, are used to curve or fold planar structures into three dimensional (3D) structures. In doing so, we make it possible to mass produce precisely patterned static and reconfigurable particles that are challenging to synthesize.
In this paper, we detail visualized experimental protocols to create patterned particles, notably, (a) permanently bonded, hollow, polyhedra that self-assemble and self-seal due to the minimization of surface energy of liquefied hinges21-23 and (b) grippers that self-fold due to residual stress powered hinges24,25. The specific protocol described can be used to create particles with overall sizes ranging from the micrometer to the centimeter length scales. Further, arbitrary patterns can be defined on the surfaces of the particles of importance in colloidal science, electronics, optics and medicine. More generally, the concept of self-assembling mechanically rigid particles with self-sealing hinges is applicable, with some process modifications, to the creation of particles at even smaller, 100 nm length scales22, 26 and with a range of materials including metals21, semiconductors9 and polymers27. With respect to residual stress powered actuation of reconfigurable grasping devices, our specific protocol utilizes chromium hinges of relevance to devices with sizes ranging from 100 &mu;m to 2.5 mm. However, more generally, the concept of such tether-free residual stress powered actuation can be used with alternate high-stress materials such as heteroepitaxially deposited semiconductor films5,7 to possibly create even smaller nanoscale grasping devices.

We describe experimental details of the synthesis of patterned and reconfigurable particles from two dimensional (2D) precursors. This methodology can be used to create particles in a variety of shapes including polyhedra and grasping devices at length scales ranging from the micro to centimeter scale.

Origami Inspired Auto-assemblage de particules à motifs et reconfigurable

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Recherche

Chimie

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

Isolement et caractérisation chimique du lipide A de bactéries à Gram négatif

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

Nucléosidiques Triphosphates - de la synthèse à caractérisation biochimique

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

Préparation de Mica et Silicon substrats pour l&#39;ADN Origami Analyse et Expérimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the rapid growing of congeners. DNA aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward highly hydrophobic small molecule targets, such as PAEs, is rarely reported. This work describes a bead-based method designed to select group-specific DNA aptamers to PAEs. The amino group functionalized dibutyl phthalate (DBP-NH2) as the anchor target was synthesized and immobilized on the epoxy-activated agarose beads, allowing the display of the phthalic ester group at the surface of the immobilization matrix, and therefore the selection of the group-specific binders. We determined the dissociation constants of the aptamer candidates by quantitative polymerization chain reaction coupled with magnetic separation. The relative affinities and selectivity of the aptamers to other PAEs were determined by the competitive assays, where the aptamer candidates were pre-bounded to the DBP-NH2 attached magnetic beads and released to the supernatant upon incubation with the tested PAEs or other potential interfering substances. The competitive assay was applied because it provided a facile affinity comparison among PAEs that had no functional groups for surface immobilization. Finally, we demonstrated the fabrication of an electrochemical aptasensor and used it for ultrasensitive and selective detection of bis(2-ethylhexyl) phthalate. This protocol provides insights for the aptamer discovery of other hydrophobic small molecules.

A protocol for the in vitro selection and characterization of group-specific phthalic acid ester- binding DNA aptamers is presented. The application of the selected aptamer in an electrochemical aptasensor is also included.

Phthalic Acid Ester-liaison ADN aptamère sélection, caractérisation et Application d’un Aptasensor électrochimique

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

Motifs d’ADN stable, 1D et 2D Nanostructures construit à partir de molécules d’ADN circulaire petit

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in physiological fluids induce denaturation and degradation of self-assembled DNA nanostructures. In non-viral gene delivery, enzymatic degradation of DNA is overcome by the encapsulation of the negatively charged DNA in a cationic shell. Herein, inspired by gene delivery advancements, a simple, one-step and robust methodology is presented for the stabilization of DNA origami nanostructures by coating them with chitosan and linear polyethyleneimine. The polycation coating efficiently protects DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media. This method also preserves the full addressability of enzyme- and aptamer-based functionalization of DNA nanostructures.

Here, a protocol for the protection of DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media using natural cationic polysaccharide chitosan and synthetic linear polyethyleneimine (LPEI) coatings is presented.

Thérapie génique inspiré Polycation enduit pour la Protection de l’ADN Origami Nanostructures

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...

Assembly of Gold Nanorods into Chiral Plasmonic Metamolecules Using DNA Origami Templates

The inherent addressability of DNA origami structures makes them ideal templates for the arrangement of metal nanoparticles into complex plasmonic nanostructures. The high spatial precision of a DNA origami-templated assembly allows controlling the coupling between plasmonic resonances of individual particles and enables tailoring optical properties of the constructed nanostructures. Recently, chiral plasmonic systems attracted a lot of attention due to the strong correlation between the spatial configuration of plasmonic assemblies and their optical responses (e.g., circular dichroism [CD]). In this protocol, we describe the whole workflow for the generation of DNA origami-based chiral assemblies of gold nanorods (AuNRs). The protocol includes a detailed description of the design principles and experimental procedures for the fabrication of DNA origami templates, the synthesis of AuNRs, and the assembly of origami-AuNR structures. In addition, the characterization of structures using transmission electron microscopy (TEM) and CD spectroscopy is included. The described protocol is not limited to chiral configurations and can be adapted for the construction of various plasmonic architectures.

We describe the detailed protocol for the DNA origami-based assembly of gold nanorods into chiral plasmonic metamolecules with strong chiroptical responses. The protocol is not limited to chiral configurations and can be easily adapted for the fabrication of various plasmonic architectures.

Assemblage de Nanotiges or dans Metamolecules plasmoniques chiraux, à l’aide de modèles d’Origami ADN

The inherent addressability of DNA origami structures makes them ideal templates for the arrangement of metal nanoparticles into complex plasmonic ...

DNA Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA nanofabrication technique is called DNA origami, and it allows high-throughput synthesis of accurate and highly versatile structures with nanometer-level precision. Here, it is shown how the spatial information of DNA origami can be transferred to metallic nanostructures by combining the bottom-up DNA origami with the conventionally used top-down lithography approaches. This allows fabrication of billions of tiny nanostructures in one step onto selected substrates. The method is demonstrated using bowtie DNA origami to create metallic bowtie-shaped antenna structures on silicon nitride or sapphire substrates. The method relies on the selective growth of a silicon oxide layer on top of the origami deposition substrate, thus resulting in a patterning mask for following lithographic steps. These nanostructure-equipped surfaces can be further used as molecular sensors (e.g., surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS)) and in various other optical applications at the visible wavelength range owing to the small feature sizes (sub-10 nm). The technique can be extended to other materials through methodological modifications; therefore, the resulting optically active surfaces may find use in development of metamaterials and metasurfaces.

Here, we describe a protocol to create discrete and accurate inorganic nanostructures on substrates using DNA origami shapes as guiding templates. The method is demonstrated by creating plasmonic gold bowtie-shaped antennas on a transparent substrate (sapphire).

ADN Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA ...

Mesures SERS d’une seule molécule rendues possibles par des nanoantennes d’origami d’ADN plasmonique

Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Scattering Measurements Enabled by Plasmonic DNA Origami Nanoantennas

Surface-enhanced Raman scattering (SERS) has the capability to detect single molecules for which high field enhancement is required. Single-molecule (SM) SERS is able to provide molecule-specific spectroscopic information about individual molecules and therefore yields more detailed chemical information than other SM detection techniques. At the same time, there is the potential to unravel information from SM measurements that remain hidden in Raman measurements of bulk material. This protocol outlines the SM SERS measurements using a DNA origami nanoantenna (DONA) in combination with atomic force microscopy (AFM) and Raman spectroscopy. A DNA origami fork structure and two gold nanoparticles are combined to form the DONAs, with a 1.2-2.0 nm gap between them. This allows an up to 1011-fold SERS signal enhancement, enabling measurements of single molecules. The protocol further demonstrates the placement of a single analyte molecule in a SERS hot spot, the process of AFM imaging, and the subsequent overlaying of Raman imaging to measure an analyte in a single DONA.

Pleins feux sur l’auteur : Mesures de diffusion Raman améliorées en surface d’une seule molécule rendues possibles par des nanoantennes d’origami d’ADN plasmonique  

This protocol demonstrates single-molecule surface-enhanced Raman scattering (SERS) measurements using a DNA origami nanoantenna (DONA) combined with colocalized atomic force microscopy (AFM) and Raman measurements.

Mesures de diffusion Raman améliorées en surface à molécule unique rendues possibles par des nanoantennes d’origami d’ADN plasmonique

Surface-enhanced Raman scattering (SERS) has the capability to detect single molecules for which high field enhancement is required. Single-molecule (SM) ...