Ces méthodes peuvent être utilisées pour déterminer les facteurs qui influencent l’invasion trophoblaste qui peuvent fournir un aperçu des principaux résultats obstétricaux indésirables. L’avantage de cette technique est qu’elle fournit une analyse visuelle et quantitative de plusieurs facteurs qui peuvent influencer l’invasion des trophoblastes, y compris la prolifération et la migration. Pour commencer l’analyse à gratter, ensemencer le nombre approprié de cellules dans une plaque de 24 puits pour atteindre 100% confluence en 48 heures.
Le lendemain, changer les médias en phénol rouge médias libres complétés par la chaleur inactivée charbon de bois dextran dépouillé FBS. Le jour de l’égratignure, ajouter le traitement désiré aux médias dans chaque puits pour prétratre les cellules pendant 30 minutes. Pour créer des plaies uniformes, placez des pointes stériles de pipette de 10 microlitres sur les broches de l’outil de fabricant de plaies.
Abaissez les pointes dans la première rangée de puits et déplacez la plaque le long de la voie du fabricant de plaies jusqu’à ce que les pointes de pipette atteignent l’autre côté du puits. Déplacez ensuite la plaque vers la position de départ pour assurer une plaie constante sur le diamètre du puits. Abaissez les pointes dans la rangée suivante de puits et répétez jusqu’à ce que tous les puits soient rayés.
Confirmez que l’égratignure couvre la largeur du puits en observant la plaque au microscope. Ensuite, aspirez soigneusement le média et lavez doucement les cellules avec 1x PBS deux fois. Après un lavage final, ajouter le phénol complété rouge dénudé ou faible teneur en FBS avec un traitement désiré.
Ensuite, placez la plaque avec les puits rayés dans un imageur de timelapse automatisé logé dans un incubateur qui contient 37 degrés Celsius de température et 5% de dioxyde de carbone à 95% d’humidité atmosphère. Imagez les cellules à intervalles réguliers au besoin pour permettre aux cellules d’achever la cicatrisation des plaies. Pour commencer l’analyse d’invasion, ensemencer le nombre approprié de cellules dans des plaques de six puits dans un incubateur qui maintient une température de 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone à 95% d’humidité atmosphérique.
Permettre aux cellules d’atteindre 90% de confluence en 48 heures. Le lendemain, changer les médias en phénol rouge médias libres complétés par la chaleur inactivée charbon de bois dextran dépouillé FBS. Placer un flacon de 10 milligrammes par matrice extracellulaire millilitre dans un réfrigérateur sur la glace et laisser décongeler toute la nuit.
Le lendemain, utilisez des pointes de pipette réfrigérées pour diluer 10 milligrammes par millilitre de la matrice extracellulaire avec le phénol rouge libre de sérum médias libres à une concentration finale de cinq milligrammes par millilitre. Ajouter ensuite 100 millilitres de matrice extracellulaire diluée aux inserts réfrigérés qui ont été placés dans la plaque réfrigérée de 24 puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pour permettre à la matrice de durcir.
Pour préparer les cellules pour l’analyse d’invasion, laver les cellules avec un millilitre de 1x PBS. Ensuite, aspirez le PBS et ajouter 500 microlitres de 1x Trypsin EDTA à chaque puits. Placez la plaque de six puits dans l’incubateur qui maintient une température de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans l’atmosphère de 95 % d’humidité jusqu’à ce que toutes les cellules se soient détachées du fond de la plaque.
Une fois que les cellules se sont détachées, ajouter 500 microlitres du phénol rouge libre sérum médias libres à chaque puits des cellules trypsinisées. Ensuite, transférez 1000 microlitres de cellules détachées dans un tube de microcentrifugeuse et tournez vers le bas pendant cinq minutes à 400 fois g à quatre degrés Celsius. Ensuite, aspirez les médias et resuspendez les cellules dans le phénol rouge libre sérum médias libres.
Comptez les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé et ajustez le volume de la suspension cellulaire pour une concentration finale de 0,5 million de cellules par millilitre. Ajouter 600 microlitres du média de croissance complet à chaque puits de la plaque de 24 puits et y placer l’insert pré-enduit. Ajoutez ensuite 200 microlitres de cellules au-dessus de chaque insert cellulaire pré-enduit pour un total de 0,1 million de cellules.
Placez la plaque de 24 puits dans l’incubateur qui maintient une température de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone à 95 % d’humidité pendant 24 heures. Après l’incubation pendant la nuit, aspiration du reste des médias des chambres supérieures et inférieures sans perturber la matrice extracellulaire. Retirez ensuite soigneusement la matrice extracellulaire et les cellules non envahies de la partie supérieure des inserts à l’aide d’un coton-tige.
Lavez chaque insert trois fois en ajoutant 1x PBS aux chambres supérieures et inférieures du puits. Aspirer PBS après chaque lavage. Pour fixer les cellules attachées aux inserts, placez les inserts dans du méthanol froid à 100 % glacé à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.
Lavez les inserts trois fois avec 1x PBS et retirez PBS après le lavage final. Tacher les cellules attachées aux inserts avec 0,2% de violet cristal dans 20% d’éthanol pendant 10 minutes. Rincer à l’eau déionisée trois fois et aspirer l’eau déionisée après le lavage final.
Inserts secs à l’air à température ambiante pendant une heure. Enfin à l’aide de forceps et d’une lame de rasoir, couper soigneusement la membrane inférieure de l’insert et le monter sur une glissière de verre avec le côté inférieur face vers le haut. À l’aide d’un microscope léger dont l’objectif est de 20 X, obtenez au moins quatre images uniques des cellules envahies par échantillon.
Pour commencer l’analyse de prolifération, utilisez un compteur de cellules automatisé pour compter les cellules trypsinisées du flacon. Cellules de graine dans des plaques de six puits à une densité de 0,2 million de cellules par puits dans les médias de croissance standard. Placez ensuite les cellules dans l’incubateur qui maintient une température de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone à 95 % d’humidité pendant quatre heures ou jusqu’à ce que les cellules aient adhéré.
Ensuite, changer les médias en phénol rouge médias libres complétés par la chaleur inactivée charbon de bois dextran dépouillé FBS et le traitement désiré. Placez la plaque de six puits dans l’incubateur qui maintient une température de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone à 95 % d’humidité atmosphérique. Remplacez ensuite les médias par les médias frais complétés par le traitement désiré toutes les 48 heures.
Après 24, 48 ou 72 heures de traitement, laver les cellules avec un millilitre de 1x PBS et ajouter 500 microlitres de Trypsin EDTA à chaque puits. Placer une plaque de six puits dans l’incubateur jusqu’à ce que les cellules se soient détachées de la plaque. Une fois que les cellules se sont détachées de la plaque, ajouter 500 microlitres du phénol supplémentaire rouge médias libres pour désactiver trypsine.
Enfin, ajouter cinq microlitres des cellules trypsinisées à cinq microlitres de Trypan Blue dans un tube séparé et mélanger par pipetting. Utilisez un compteur cellulaire automatisé pour compter les cellules de chaque puits en double. Immortalisé humain premier trimestre trophoblast Swan.
71 cellules ont été traitées pendant zéro, huit, et 18 heures avec le véhicule 1x PBS ou 100 micromolar de la dexaméthasone glucocorticoid synthétique dans l’essai de éraflure. Mesure de la taille de la plaie et de la densité de la plaie dans Swan. Les cellules 71 et HTR-8/SVneo traitées avec un véhicule ou une dex de 100 nanomolaires ont montré que le traitement par dex réduisait le taux de fermeture des plaies, ce qui indique que les glucocorticoïdes pouvaient inhiber la migration cellulaire.
Après l’essai d’invasion, le traitement glucocorticoid a réduit l’envahissement cellulaire comme montré par une réduction de 15% du nombre de cygne envahi. 71 cellules HTR-8/SVneo traitées avec 100 nanomolaires dex pendant 24 heures par rapport aux cellules traitées avec le véhicule. Après l’essai de prolifération cellulaire, le traitement glucocorticoïde a réduit la prolifération cellulaire comme indiqué par moins de cygne.
71 cellules HTR-8/SVneo traitées avec 100 nanomolaires dex par rapport aux cellules traitées avec le véhicule. Des méthodes pour évaluer la mort cellulaire pourraient être employées en même temps que cette procédure pour déterminer si l’apoptose ou la nécrose contribuent aux fonctions altérées de trophoblaste. Nous avons adopté de façon unique l’utilisation de techniques standard couramment utilisées en biologie du cancer pour l’étude de la fonction trophoblaste.
Il n’y a aucun danger associé à ces méthodes. La seule précaution que les téléspectateurs devraient prendre est d’utiliser une technique stérile pour la culture des tissus.
