Bu yöntemler, büyük advers obstetrik sonuçlara ışık tutabilecek trofoplast invazyonunu etkileyen faktörleri belirlemek için kullanılabilir. Bu tekniğin avantajı, proliferasyon ve göç de dahil olmak üzere trofoplast invazyonu etkileyebilecek çeşitli faktörlerin görsel ve nicel analizini sağlamasıdır. Çizik teşbine başlamak için, 48 saat içinde %100 biraraya gelmek için uygun sayıda hücreyi 24 kuyulu bir plakaya yerleştirin.
Ertesi gün, fenol kırmızı serbest medya ısı inaktive kömür dextran ile desteklenen medya değiştirmek FBS sıyrılmış. Çizik gününde, 30 dakika boyunca hücreleri pretreat her kuyuda ortama istenilen tedavi ekleyin. Düzgün yaralar oluşturmak için, yara makinesi aracının pimlerine steril 10 mikrolitrelik pipet uçları yerleştirin.
Uçları kuyuların ilk sırasına indirin ve pipet uçları kuyunun diğer tarafına ulaşana kadar plakayı yara makinesinin izini hareket ettirin. Daha sonra kuyunun çapı boyunca sürekli bir yara sağlamak için plakayı başlangıç pozisyonuna geri taşıyın. İpuçlarını bir sonraki kuyu sırasına indirin ve tüm kuyular çizilene kadar tekrarlayın.
Bir mikroskop altında plaka gözlemleyerek çizik kuyunun genişliğini kapsadığını onaylayın. Daha sonra, ortama dikkatlice aspire edin ve hücreleri iki kez 1x PBS ile nazikçe yıkayın. Son bir yıkama sonrasında, istenilen bir tedavi ile takviye fenol kırmızı ücretsiz sıyrılmış veya düşük FBS medya ekleyin.
Daha sonra, 37 derece santigrat sıcaklık ve% 95 nem atmosferinde% 5 karbondioksit içeren bir kuluçka içinde bulunan otomatik bir timelapse görüntüleyici içinde çizik kuyular ile plaka yerleştirin. Hücrelerin yara iyileşmesini tamamlamasını sağlamak için hücreleri gerektiği gibi düzenli aralıklarla görüntüleyin. İstila sınamaya başlamak için, uygun sayıda hücreyi 37 santigrat derece sıcaklık ve %95 nem atmosferinde %5 karbondioksit koruyan bir kuluçka makinesinde altı kuyulu plakaya yerleştirin.
Hücrelerin 48 saat içinde %90'a ulaşmasına izin verin. Ertesi gün, fenol kırmızı serbest medya ısı inaktive kömür dextran ile desteklenen medya değiştirmek FBS sıyrılmış. Bir buz üzerinde bir buzdolabı na mililitre ekstrasellüler matris başına 10 miligram bir şişe yerleştirin ve bir gecede çözülmeye izin.
Ertesi gün, mililitre başına 10 miligram mililitre başına fenol kırmızıserbest serum serbest medya ile mililitre başına beş miligram son konsantrasyonu için soğutulmuş pipet ipuçları kullanın. Daha sonra soğutulmuş 24 kuyulu plaka yerleştirilmiş soğutulmuş ekler için seyreltilmiş ekstrasellüler matris 100 mililitre ekleyin. Matrisin sertleşebilmesi için plakayı 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
İnvazyon tadına göre hücreleri hazırlamak için hücreleri bir mililitre 1x PBS ile yıkayın. Sonra PBS aspire ve her kuyuya 1x Trypsin EDTA 500 mikrolitre ekleyin. Tüm hücreler tabağın altından ayrılana kadar 37 santigrat derece sıcaklık ve %5 karbondioksit %95 nem atmosferine sahip olan altı kuyulu plakayı kuvöze yerleştirin.
Hücreler ayrıldıktan sonra, tripzinli hücrelerin her kuyuya 500 mikrolitre fenol kırmızısı serbest serumsuz ortam ekleyin. Sonra 1,000 mikrolitre müstakil hücreyi mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 400 kez g'de dört santigrat derecede beş dakika aşağı doğru döndürün. Daha sonra, medya aspire ve fenol kırmızı serbest serum serbest ortamda hücreleri yeniden askıya.
Hücreleri otomatik bir hücre sayacı kullanarak sayın ve mililitre başına 0,5 milyon hücrelik son konsantrasyon için hücre süspansiyonunun hacmini ayarlayın. 24 kuyulu plakanın her kuyuya tam büyüme ortamının 600 mikrolitresini ekleyin ve önceden kaplanmış kesici kesici yi içine yerleştirin. Daha sonra, toplam 0,1 milyon hücre için önceden kaplanmış her hücre ucunun üzerine 200 mikrolitre hücre ekleyin.
24-iyi plaka 24 saat boyunca% 95 nem atmosferinde 37 derece santigrat sıcaklık ve% 5 karbondioksit korur kuvöz yerleştirin. Gece kuluçkasını takiben, kalan ortamı hücre dışı matrisi bozmadan üst ve alt odalardan emdirin. Daha sonra hücre dışı matrisi ve işgal edilmeyen hücreleri bir pamuklu bezle kesici uçların üst kısmından dikkatlice çıkarın.
Kuyunun hem üst hem de alt odalarına 1x PBS ekleyerek her kesici ucu üç kez yıkayın. Her yıkamadan sonra PBS aspire edin. Kesici uçlara bağlı hücreleri onarmak için kesici uçları 30 dakika boyunca 4 derece lik buz gibi metanolün içine yerleştirin.
Kesici uçları 1x PBS ile üç kez yıkayın ve son yıkamadan sonra PBS'yi çıkarın. 10 dakika boyunca% 20 etanol% 0.2 kristal menekşe ile eklere bağlı hücreleri leke. Son yıkamadan sonra deiyonize su ile üç kez durulayın ve deiyonize su aspire edin.
Oda sıcaklığında bir saat boyunca hava kuru ekler. Son olarak, forceps ve jilet kullanarak, dikkatle kesici uç alt membran kesilmiş ve alt tarafı yukarı bakacak şekilde bir cam slayt üzerine monte. 20X hedefi olan bir ışık mikroskobu kullanarak, numune başına işgal edilen hücrelerin en az dört benzersiz görüntüsünü elde edin.
Proliferasyon ttahminine başlamak için, şişedeki trypsed hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayacı kullanın. Tohum hücreleri standart büyüme ortamlarında her biri 0,2 milyon hücre yoğunluğunda altı kuyulu plakalara dönüşür. Daha sonra hücreleri, 37 santigrat derece sıcaklık ve %5 karbondioksit imuhafaza eden hücreleri dört saat boyunca veya hücreler yapışana kadar %95 nem atmosferinde yerleştirin.
Daha sonra, ısı inaktive kömür dextran fbs ve istenen tedavi sıyrılmış ile desteklenen fenol kırmızı serbest medya için medya değiştirin. %95 nem atmosferinde 37 santigrat derece sıcaklık ve %5 karbondioksit tutan altı kuyulu plakayı kuvöze yerleştirin. Daha sonra her 48 saatte bir istenilen tedavi ile desteklenen taze medya ile medya değiştirin.
24, 48 veya 72 saatlik tedaviden sonra hücreleri bir mililitre 1x PBS ile yıkayın ve her kuyuya 500 mikrolitre Trypsin EDTA ekleyin. Hücreler plakadan ayrılana kadar altı kuyuluk bir plakayı kuvöze yerleştirin. Hücreler plakadan ayrıldıktan sonra, Trypsin'i devre dışı bırakmak için eklenmiş fenol kırmızısı serbest ortam500 mikrolitre ekleyin.
Son olarak, trypsed hücrelerin beş mikrolitre trypan Mavi ayrı bir tüp içinde beş mikrolitre ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Yinelenen her kuyudaki hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayacı kullanın. Ölümsüzleştirilmiş insan ilk trimester trophoblast Kuğu.
Sıfır, sekiz ve 18 saat boyunca sıfır, sekiz ve 18 saat boyunca, sıfır da sayılma da sentetik glukokortikoid deksametazon 100 mikromolar ile tedavi edildi. Kuğu'daki yara büyüklüğünün ve yara yoğunluğunun ölçümü. 71 ve HTR-8/SVneo hücreleri araç veya 100 nanomolar deks ile tedavi glukokortikoidlerin hücre göçlerini inhibe edebileceğini gösteren yara kapatma oranını azalttığını göstermiştir.
İstila yıprandısonra, glukokortikoid tedavisi, işgal edilen Kuğu sayısında %15'lik bir azalma ile gösterildiği gibi hücre invazivliğini azalttı. 71 ve HTR-8/SVneo hücreleri araç ile tedavi edilen hücrelere göre 24 saat boyunca 100 nanomolar deks ile tedavi edilir. Hücre proliferasyon sabunu sonrasında, glukokortikoid tedavisi daha az Kuğu tarafından belirtildiği gibi hücre çoğalmasını azalttı.
71 ve HTR-8/SVneo hücreleri araç ile tedavi edilen hücrelere göre 100 nanomolar deks ile tedavi edilir. Hücre ölümünü değerlendirme yöntemleri, apoptoz veya nekrozun değiştirilmiş trofoblast fonksiyonlarına katkıda bulunup bulunmadığını belirlemek için bu prosedürle birlikte kullanılabilir. Biz benzersiz trophoblast fonksiyonunun çalışması için rutin kanser biyolojisinde kullanılan standart tekniklerin kullanımını benimsemiştir.
Bu yöntemlerle ilişkili herhangi bir tehlike yoktur. İzleyicilerin alması gereken tek önlem doku kültürü için steril teknik kullanmaktır.
