이러한 방법은 주요 불리 한 산부인과 결과에 대 한 통찰력을 제공할 수 있는 trophoblast 침략에 영향을 미치는 요인을 결정 하기 위해 활용 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 증식 및 마이그레이션을 포함한 트로포블라스트 침공에 영향을 미칠 수 있는 여러 요인에 대한 시각적 및 정량적 분석을 제공한다는 것입니다. 스크래치 분석서를 시작하려면 적절한 수의 세포를 24웰 플레이트로 시드하여 48시간 만에 100%의 인플루엔기를 달성합니다.
다음 날, 열을 비활성화 탄 dextran 박탈 FBS로 보충 페놀 레드 무료 미디어로 미디어를 변경합니다. 스크래치 당일, 각 우물의 미디어에 원하는 치료를 추가하여 30 분 동안 세포를 퇴각시하십시오. 균일한 상처를 만들려면 멸균 10 마이크로리터 파이펫 팁을 상처 제조자 도구의 핀에 놓습니다.
팁을 우물의 첫 번째 행으로 낮추고 파이펫 팁이 우물의 반대편에 도달 할 때까지 상처 메이커의 트랙을 따라 접시를 이동합니다. 그런 다음 플레이트를 다시 시작 위치로 이동하여 우물의 직경에 걸쳐 일정한 상처를 보장합니다. 팁을 다음 우물행으로 낮추고 모든 우물이 긁히때까지 반복합니다.
스크래치가 현미경으로 플레이트를 관찰하여 우물의 폭을 커버하는지 확인합니다. 다음으로, 조심스럽게 미디어를 흡인하고 부드럽게 두 번 1x PBS로 세포를 씻어. 마지막 세척 후, 원하는 치료와 보충 페놀 레드 프리 스트립 또는 낮은 FBS 미디어를 추가합니다.
다음으로, 긁힌 우물이 있는 접시를 섭씨 37도, 습도 가 95%의 습도 대기시 이산화탄소 5%가 들어 있는 인큐베이터에 보관된 자동 타임랩스 이미저에 놓습니다. 세포가 상처 치유를 완료할 수 있도록 필요에 따라 정기적으로 세포를 이미지합니다. 침략 분석서를 시작하려면 적절한 수의 세포를 섭씨 37도, 습도 가95%의 습도 대기에서 5%의 이산화탄소를 유지하는 인큐베이터에서 적절한 수의 세포를 6웰 플레이트로 시드합니다.
세포가 48시간 안에 90%의 합류에 도달할 수 있도록 합니다. 다음 날, 열을 비활성화 탄 dextran 박탈 FBS로 보충 페놀 레드 무료 미디어로 미디어를 변경합니다. 얼음에 냉장고에 밀리리터 세포 외 매트릭스 당 10 밀리그램의 유리병을 배치하고 하룻밤 해동하자.
다음 날, 차가운 파이펫 팁을 사용하여 페놀 레드 프리 세럼 프리 미디어와 세포외 매트릭스의 밀리리터 당 10 밀리그램을 희석하여 밀리리터당 5밀리그램의 최종 농도로 희석합니다. 그런 다음 희석된 세포외 매트릭스의 100 밀리리터를 차가운 24웰 플레이트에 넣은 차가운 인서츠에 추가합니다. 매트릭스가 경화 할 수 있도록 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.
침략 분석에 대한 세포를 준비하려면 1 x PBS의 1 밀리리터로 세포를 씻으하십시오. 그런 다음 PBS를 흡인하고 각 우물에 1x 트립신 EDTA의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 모든 세포가 플레이트 바닥에서 분리 될 때까지 섭씨 37도 의 온도와 5 %의 습도 대기를 유지하는 인큐베이터에 6 웰 플레이트를 놓습니다.
세포가 분리되면, 트립시네이드 셀의 각 웰에 페놀 레드 프리 세럼 무료 매체의 500 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 분리 된 세포의 1, 000 마이크로 리터를 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 섭씨 400 회에서 5 분 동안 회전합니다. 다음으로, 미디어를 흡인하고 페놀 레드 프리 세럼 프리 미디어에서 세포를 재분리한다.
자동 세포 카운터를 사용하여 세포를 계산하고 밀리리터 당 0.5 백만 세포의 최종 농도에 대한 세포 현탁액의 볼륨을 조정합니다. 전체 성장 매체의 600 마이크로리터를 24웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 미리 코팅된 인서트를 넣습니다. 그런 다음 총 010만 개의 세포에 대해 미리 코팅된 각 세포 인서치 위에 200마이크로리터의 셀을 추가합니다.
섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 24시간 동안 95% 습도 대기에 보관하는 인큐베이터에 24웰 플레이트를 배치합니다. 하룻밤 잠복 에 이어, 세포 외 매트릭스를 방해하지 않고 상부 및 하부 챔버에서 나머지 미디어를 흡입. 그런 다음 면봉을 가진 인서트 의 상부에서 세포외 매트릭스및 비침범된 세포를 조심스럽게 제거합니다.
웰의 상부 및 하부 챔버에 1x PBS를 추가하여 각 삽입을 세 번 세척합니다. 세척 할 때마다 PBS를 흡인하십시오. 인서트에 부착된 세포를 고정하려면 인서트를 섭씨 4도에서 100%의 얼음 차가운 메탄올에 넣고 30분간 놓습니다.
1x PBS로 세 번 인서트를 세척하고 최종 세척 후 PBS를 제거합니다. 10 분 동안 20 %의 에탄올에 0.2 %의 크리스탈 바이올렛으로 삽입에 부착 된 세포를 얼룩. 탈이온된 물로 세 번 헹구고 최종 세척 후 탈화물 이온수를 흡수합니다.
실온에서 1시간 동안 공기 건조 인서트. 마지막으로 집게와 면도날을 사용하여 인서트의 하단 멤브레인을 조심스럽게 잘라 하단면이 위로 향하는 유리 슬라이드에 장착하십시오. 20X 목표를 가진 광 현미경을 사용하여, 샘플 당 침략 된 세포의 적어도 네 개의 고유 한 이미지를 얻을.
증식 분석서를 시작하려면 자동화된 셀 카운터를 사용하여 플라스크에서 트립시화된 셀을 계산합니다. 종자 세포는 표준 성장 매체에서 우물 당 0.2 백만 세포의 밀도로 6 웰 플레이트로 종자 세포. 그런 다음 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 4시간 동안 또는 세포가 부착할 때까지 95%의 습도 대기에 보관합니다.
다음으로, 열을 비활성화 한 숯 dextran 박탈 FBS와 원하는 치료로 보충 페놀 레드 프리 미디어로 미디어를 변경합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 유지하며 습도가 95%에 달하는 인큐베이터에 6웰 플레이트를 배치합니다. 그런 다음 미디어를 48시간마다 원하는 치료로 보충한 신선한 매체로 대체합니다.
24, 48, 또는 72 시간 치료 후, 1 x PBS의 1 밀리리터로 세포를 세척하고 각 우물에 트립신 EDTA의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 세포가 플레이트에서 분리 될 때까지 인큐베이터에 6 웰 플레이트를 놓습니다. 세포가 접시에서 분리되면 트립신을 비활성화하기 위해 보충 페놀 레드 프리 미디어의 500 마이크로 리터를 추가합니다.
마지막으로 트립시닉 된 세포의 5 마이크로 리터를 별도의 튜브에 Trypan Blue의 5 마이크로 리터에 추가하고 파이펫팅으로 혼합하십시오. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 각 웰의 셀을 복제하여 계산합니다. 불멸의 인간 최초의 삼보격 트로포블라스트 백조.
71세포는 스크래치 분석에서 합성 글루코코르티코이드 덱사메타손의 차량 1x PBS 또는 100 마이크로몰로 0, 8, 18시간 동안 처리되었다. 백조의 상처 크기와 상처 밀도의 측정. 71 및 HTR-8/SVneo 세포는 차량 또는 100 나노몰러 덱스로 치료되어 덱스 처리가 글루코코르티코이드가 세포 이동을 저해할 수 있음을 나타내는 상처 폐쇄 속도를 감소시키는 것으로 나타났다.
침략 분석 에 이어, 글루코코르티코이드 치료는 침략된 백조의 수에 있는 15% 감소에 의해 도시된 바와 같이 세포 침략을 감소시다. 71 및 HTR-8/SVneo 세포는 차량으로 처리된 세포에 비해 24시간 동안 100 나노몰러 덱스로 처리하였다. 세포 증식 분석에 따라, 글루코코르티코이드 치료는 적은 백조에 의해 표시된 대로 세포 증식을 감소시켰다.
71 및 HTR-8/SVneo 세포는 차량으로 처리된 세포에 비해 100 나노몰러 덱스로 처리하였다. 세포 사멸을 평가하는 방법은 세포 사멸 또는 괴사 변경 된 trophoblast 기능에 기여 여부를 결정하기 위해이 절차와 함께 사용할 수 있습니다. 우리는 트로프토블라스트 기능 연구를 위해 암 생물학에서 일상적으로 사용되는 표준 기술의 사용을 독특하게 채택했습니다.
이러한 방법과 관련된 위험은 없습니다. 시청자가 취해야 할 유일한 예방 조치는 조직 배양을 위해 멸균 기술을 사용하는 것입니다.
