שיטות אלה יכולות להיות מנוצלות כדי לקבוע גורמים המשפיעים על פלישת trophoblast אשר עשוי לספק תובנה לתוצאות מיילדותיות שליליות גדולות. היתרון של טכניקה זו הוא שהיא מספקת ניתוח חזותי וכמותי של מספר גורמים שעשויים להשפיע על פלישת trophoblast כולל התפשטות והגירה. כדי להתחיל את מרד השריטה, זרע את המספר המתאים של תאים לתוך צלחת 24 באר כדי להשיג 100% confluence ב 48 שעות.
למחרת, לשנות את התקשורת כדי פנול אדום חינם מדיה בתוספת חום dextran פחם שהופשט FBS. ביום השריטה, מוסיפים את הטיפול הרצוי לתקשורת בכל באר כדי לפנות את התאים במשך 30 דקות. כדי ליצור פצעים אחידים, מניחים 10 טיפים פיפטה microliter סטרילי על הסיכות של כלי יצרנית הפצע.
מנמיך את הטיפים לשורה הראשונה של בארות ומזיזים את הצלחת לאורך המסלול של יצרנית הפצעים עד שטיפים פיפטה להגיע לצד השני של הבאר. ואז להזיז את הצלחת בחזרה למצב ההתחלה כדי להבטיח פצע מתמיד על פני קוטר הבאר. מנמיך את הטיפים לשורה הבאה של בארות וחוזר חלילה עד שכל הבארות שרוטות.
אשר כי השריטה מכסה את רוחב באר על ידי התבוננות הצלחת תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, בזהירות שאפו את המדיה ושטפו בעדינות את התאים עם 1x PBS פעמיים. לאחר שטיפה סופית, להוסיף תוספת פנול אדום חינם הפשיטו או מדיה נמוכה FBS עם הטיפול הרצוי.
לאחר מכן, מניחים את הצלחת עם הבאר השרוטה בתמונה אוטומטית timelapse שוכנת באינקובטור המכיל 37 מעלות צלזיוס טמפרטורה ו 5% פחמן דו חמצני ב 95% לחות האטמוספירה. תמונה התאים במרווחי זמן קבועים לפי הצורך כדי לאפשר לתאים להשלים ריפוי פצעים. כדי להתחיל את בדיקת הפלישה, זורעים את המספר המתאים של תאים לתוך צלחות שש בארות באינקובטור השומר על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני באטמוספירה של 95%.
אפשר לתאים להגיע ל- 90%confluence ב- 48 שעות. למחרת, לשנות את התקשורת כדי פנול אדום חינם מדיה בתוספת חום dextran פחם שהופשט FBS. מניחים בקבוקון של 10 מיליגרם למטריצה חוץ-תאית מיליליטר במקרר על קרח ונותנים להפשיר בן לילה.
יום לאחר מכן, השתמש טיפים פיפטה מצוננת לדלל 10 מיליגרם למיליליטר של מטריצה חוץ תאית עם פנול אדום חופשי סרום חינם מדיה לריכוז סופי של חמישה מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן הוסיפו 100 מיליליטר של מטריצה חוץ-תאית מדוללת לתוספים מצוננים שהונחו בצלחת 24 המצוננת. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר למטריצה להקשיח.
כדי להכין תאים למבחן הפלישה, לשטוף תאים עם מיליליטר אחד של 1x PBS. לאחר מכן שאפו את ה-PBS והוסיפו 500 מיקרוליטרים של 1x טריפסין EDTA לכל באר. מניחים את צלחת שש באר באינקובטור אשר שומר על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני ב 95% לחות האטמוספירה עד שכל התאים התנתקו מתחתית הצלחת.
לאחר התאים התנתקו, להוסיף 500 microliters של פנול אדום חופשי סרום מדיה חופשית לכל באר של תאים טריפסיניים. ואז להעביר 1,000 microliters של תאים מנותקים לצינור microcentrifuge ולסובב למטה במשך חמש דקות ב 400 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאפו את המדיה והשקיעו מחדש את התאים במדיה החופשית החופשית של הסרום האדום של פנול.
לספור תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי ולהתאים את נפח ההשעיה התא לריכוז סופי של 0.5 מיליון תאים למיליליטר. הוסיפו 600 מיקרוליטרים של מדיית הצמיחה המלאה לכל באר של צלחת ה-24 באר והכניסו לתוכה את התוספת מצופה מראש. לאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטרים של תאים מעל כל הוספת תא מצופה מראש עבור סך של 0.1 מיליון תאים.
מניחים את צלחת 24 באר באינקובטור אשר שומר על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני ב 95% לחות האטמוספירה במשך 24 שעות. לאחר הדגירה הלילית, יניקת התקשורת הנותרת מהתא העליון והתחתון מבלי להפריע למטריצה החוץ-תאית. לאחר מכן להסיר בזהירות את מטריצה חוץ תאית ותאים שאינם פולשים מהחלק העליון של מוסיף עם ספוגית כותנה.
לשטוף כל הכנס שלוש פעמים על ידי הוספת 1x PBS הן התאים העליונים והתחתון של באר. שאפו PBS לאחר כל שטיפה. כדי לתקן תאים המחוברים לתוספות, הנח את המכניסים לתוך 100% מתנול קר כקרח בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
לשטוף מוסיף שלוש פעמים עם 1x PBS ולהסיר PBS לאחר לשטוף הסופי. הכתם את התאים המחוברים לתוספות עם 0.2% סגול קריסטל ב 20%אתנול במשך 10 דקות. יש לשטוף במים שעברו דה-יון שלוש פעמים ולשוטוף מים שעברו דה-יון לאחר הכביסה הסופית.
אוויר יבש מוסיף בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. לבסוף באמצעות מדפים וסכין גילוח, בזהירות לחתוך את הממברנה התחתונה של הכנס ולהוות אותו על מגלשת זכוכית עם הצד התחתון פונה כלפי מעלה. באמצעות מיקרוסקופ אור עם מטרה 20X, להשיג לפחות ארבע תמונות ייחודיות של התאים פלשו לכל מדגם.
כדי להתחיל בהתנגדות לתפוצה, השתמש ב מונה תאים אוטומטי כדי לספור את התאים המהונעים מהבקבוקון. תאי זרעים לתוך שש בארות צלחות בצפיפות של 0.2 מיליון תאים לגם במדיה צמיחה סטנדרטית. לאחר מכן מניחים תאים באינקובטור השומר על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני באטמוספירה של 95% לחות במשך ארבע שעות או עד שהתאים נדבקו.
לאחר מכן, לשנות את התקשורת כדי פנול אדום חינם מדיה בתוספת חום dextran פחם שהופשט FBS ואת הטיפול הרצוי. מניחים את צלחת שש באר באינקובטור אשר שומר על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני ב 95% לחות האטמוספירה. לאחר מכן החלף את התקשורת במדיה הטרייה בתוספת הטיפול הרצוי כל 48 שעות.
לאחר 24, 48, או 72 שעות טיפול, לשטוף תאים עם מיליליטר אחד של 1x PBS ולהוסיף 500 microliters של טריפסין EDTA לכל באר. מניחים צלחת שש באר באינקובטור עד התאים התנתקו מהצלחת. לאחר שתאים התנתקו מהצלחת, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של המדיה הפנולית האדומה של פנול כדי להשבית את טריפסין.
לבסוף להוסיף חמישה microliters של תאים טריפסיניים לחמישה microliters של טריפאן כחול בצינור נפרד ומערבבים על ידי צינור. השתמש ב מונה תאים אוטומטי כדי לספור תאים מכל באר בשכפול. הנצחת האדם בשליש הראשון של הברבור הטרופובלסט.
71 תאים טופלו במשך אפס, שמונה, ו 18 שעות עם רכב 1x PBS או 100 micromolar של דקסמתזון glucocorticoid סינתטי בהסטת השריטה. מדידה של גודל הפצע וצפיפות הפצע בסוואן. 71 ו HTR-8/SVneo תאים שטופלו ברכב או 100 dex nanomolar הראו כי טיפול דקס הפחית את קצב סגירת הפצע המציין כי glucocorticoids יכול לעכב את נדידת התא.
בעקבות הפלישה, טיפול glucocorticoid מופחת פולשנות התא כפי שמוצג על ידי ירידה של 15% במספר הברבור פלש. 71 ותאי HTR-8/SVneo שטופלו ב-100 ננו-מולאר דקס במשך 24 שעות בהשוואה לתאים שטופלו ברכב. בעקבות התפשטות התאים, טיפול glucocorticoid מופחת התפשטות התא כפי שצוין על ידי פחות ברבור.
71 ותאי HTR-8/SVneo שטופלו ב-100 דקס ננומולרי בהשוואה לתאים שטופלו ברכב. שיטות להערכת מוות תאי יכול לשמש בשילוב עם הליך זה כדי לקבוע אם אפופטוזיס או נמק לתרום פונקציות trophoblast השתנה. אימצנו באופן ייחודי את השימוש בטכניקות סטנדרטיות המשמשות באופן שגרתי בביולוגיה של סרטן לחקר תפקוד הטרופובלסט.
אין סכנות הקשורות לשיטות אלה. אמצעי הזהירות היחיד שצופים צריכים לנקוט הוא שימוש בטכניקה סטרילית לתרבות הרקמות.
