Эти методы могут быть использованы для определения факторов, влияющих на вторжение в трофобласт, которые могут дать представление о основных неблагоприятных акушерских исходов. Преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает визуальный и количественный анализ нескольких факторов, которые могут повлиять на вторжение в трофобласт, включая распространение и миграцию. Чтобы начать анализ царапин, семя соответствующее количество клеток в 24-хорошо пластины для достижения 100% слияния в 48 часов.
На следующий день, изменить средства массовой информации на фенол красный свободных средств массовой информации дополняется тепло инактивированных древесного угля dextran раздели FBS. В день царапины, добавить желаемое лечение в средствах массовой информации в каждом хорошо для предварительной обработки клеток в течение 30 минут. Чтобы создать однородные раны, поместите стерильные 10 микролитровых пипеток на булавки инструмента из раны.
Опустите кончики в первый ряд скважин и переместить пластину по дорожке раны Maker до пипетки советы достичь другой стороне колодца. Затем перемести тарелку обратно в исходное положение, чтобы обеспечить постоянную рану по диаметру колодеца. Опустите кончики в следующий ряд скважин и повторяйте до тех пор, пока все скважины не поцарапаются.
Подтвердите, что царапина покрывает ширину колодец, наблюдая пластину под микроскопом. Далее, тщательно аспирировать средства массовой информации и аккуратно мыть клетки с 1x PBS в два раза. После окончательного мытья, добавить дополненный фенол красный бесплатно раздели или низким FBS средств массовой информации с желаемого лечения.
Затем поместите пластину с поцарапанными скважинами в автоматизированный образец timelapse, размещенный в инкубаторе, который содержит температуру 37 градусов по Цельсию и 5%углекислый газ при 95%влажности атмосферы. Изображение клеток на регулярной основе по мере необходимости, чтобы клетки для завершения заживления ран. Чтобы начать анализ вторжения, семя соответствующее количество клеток в шесть хорошо пластин в инкубаторе, который поддерживает температуру 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа при 95%влажности атмосферы.
Разрешить клеткам достичь 90% слияния в 48 часов. На следующий день, изменить средства массовой информации на фенол красный свободных средств массовой информации дополняется тепло инактивированных древесного угля dextran раздели FBS. Поместите флакон 10 миллиграммов на миллилитр внеклеточной матрицы в холодильник на льду и дайте оттепели на ночь.
На следующий день после этого, используйте охлажденные советы пипетки, чтобы разбавить 10 миллиграммов на миллилитр внеклеточной матрицы с фенол красный свободный сыворотки свободных средств массовой информации до окончательной концентрации пять миллиграммов на миллилитр. Затем добавьте 100 миллилитров разбавленной внеклеточной матрицы в охлажденные вставки, которые были помещены в охлажденную пластину 24-хорошо. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию, чтобы матрица затвердеет.
Для подготовки клеток к вторжению анализ, мыть клетки с одним миллилитр 1x PBS. Затем аспирировать PBS и добавить 500 микролитров 1x Трипсин EDTA к каждой хорошо. Поместите шестиявую пластину в инкубатор, который поддерживает температуру 37 градусов по Цельсию и 5%углекислый газ при 95%влажности атмосферы, пока все клетки не отсоединились от нижней части пластины.
После того, как клетки отделились, добавить 500 микролитров фенола красный свободный сыворотки свободных средств массовой информации для каждого хорошо трипсинизированных клеток. Затем перенесите 1000 микролитров отдельных клеток в трубку микроцентрифуга и вращайся вниз в течение пяти минут при 400 г при четырех градусах Цельсия. Далее, аспирировать средства массовой информации и повторно использовать клетки в фенол красный свободных средств массовой информации сыворотки.
Подсчитайте ячейки с помощью автоматизированного счетчика клеток и отрегулируйте объем клеточной подвески для окончательной концентрации 0,5 миллиона клеток на миллилитр. Добавьте 600 микролитров полного средства роста к каждому колодец 24-хорошо пластины и поместите предварительно покрытием вставить в него. Затем добавьте 200 микролитров ячеек поверх каждой предварительно покрытой клеточной вставки в общей сложности 0,1 миллиона клеток.
Поместите 24-хорошо пластины в инкубатор, который поддерживает 37 градусов по Цельсию температуры и 5%углекислого газа на 95%humidity атмосферу в течение 24 часов. После ночной инкубации всасывание остальных средств массовой информации из верхней и нижней камер, не нарушая внеклеточной матрицы. Затем аккуратно удалите внеклеточную матрицу и невлаганные клетки из верхней части вставок с помощью ватного тампона.
Вымойте каждую вставку три раза, добавив 1x PBS как в верхней, так и в нижней палатах хорошо. Аспират PBS после каждой стирки. Чтобы зафиксировать клетки, прикрепленные к вставам, поместите вставки в 100%ледяной холодный метанол при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут.
Вымойте вставки три раза с 1x PBS и удалить PBS после окончательного мытья. Пятно клеток, прикрепленных к вставки с 0,2%crystal фиолетовый в 20%ethanol в течение 10 минут. Промыть деионизированной водой три раза и аспирировать деионизированную воду после окончательной стирки.
Воздушные сухие вставки при комнатной температуре в течение одного часа. Наконец, используя типсы и лезвие бритвы, тщательно вырезать нижнюю мембрану вставки и смонтировать его на стеклянной горке с нижней стороны вверх. Используя световой микроскоп с целью 20X, получить по крайней мере четыре уникальных изображения вторглись клетки на образец.
Для начала анализа пролиферации используйте автоматизированный счетчик ячеек для подсчета трипсинизированных ячеек из колбы. Семенные клетки в шести-хорошо пластин при плотности 0,2 миллиона клеток на колодец в стандартных средств массовой информации роста. Затем поместите клетки в инкубатор, который поддерживает температуру 37 градусов по Цельсию и 5%углекислый газ при 95%влажности атмосферы в течение четырех часов или до тех пор, пока клетки придерживались.
Далее, изменить средства массовой информации на фенол красный свободных средств массовой информации дополняется тепло инактивированных древесного угля dextran раздели FBS и желаемого лечения. Поместите шестиявую пластину в инкубатор, который поддерживает температуру 37 градусов по Цельсию и 5%углекислый газ при 95%влажности атмосферы. Затем замените средства массовой информации свежими средствами массовой информации, дополненными желаемым лечением каждые 48 часов.
После 24, 48, или 72 часов лечения, мыть клетки с одним миллилитров 1x PBS и добавить 500 микролитров трипсина EDTA к каждой хорошо. Поместите шестиявую пластину в инкубатор до тех пор, пока клетки не отсоединялись от пластины. После того, как клетки отделились от пластины, добавить 500 микролитров дополнительного фенола красный свободных средств массовой информации для деактивации трипсина.
Наконец, добавьте пять микролитров трипсинизированных клеток в пять микролитров Trypan Blue в отдельную трубку и смешайте с помощью пипетки. Используйте автоматизированный счетчик ячеек для подсчета ячеек из каждого хорошо в дублировать. Увековеченный человек первого триместра трофибласт Лебедь.
71 клетки были обработаны для нуля, восемь, и 18 часов с транспортным средством 1x PBS или 100 микромоляра синтетического глюкокортикоида дексаметазона в анализе царапин. Измерение размера раны и плотности раны в Лебедином. 71 и HTR-8/SVneo клетки, обработанные транспортным средством или 100 наномолярных декс показал, что декс лечения снижение скорости закрытия раны о том, что глюкокортикоиды могут препятствовать миграции клеток.
После анализа вторжения, глюкокортикоида лечение снижение инвазивности клеток, как показано на 15%сокращение числа вторглись Лебедь. 71 и HTR-8/SVneo клетки обрабатываются 100 наномолярных декс в течение 24 часов по сравнению с клетками, обработанными транспортным средством. После анализа пролиферации клеток, глюкокортикоида лечение снижение пролиферации клеток, как указано меньше лебедя.
71 и HTR-8/SVneo клетки обрабатываются 100 наномолярных декс по сравнению с клетками, обработанными транспортным средством. Методы оценки смерти клеток могут быть использованы в сочетании с этой процедурой, чтобы определить, является ли апоптоз или некроз способствовать изменению функций трофибласта. Мы однозначно приняли использование стандартных методов, обычно используемых в биологии рака для изучения функции трофибласта.
Нет никаких опасностей, связанных с этими методами. Единственная мера предосторожности зрители должны принять с помощью стерильной техники для культуры тканей.
