Esses métodos podem ser utilizados para determinar fatores que influenciam a invasão do trophoblasto que pode fornecer insights sobre os principais desfechos obstétricos adversos. A vantagem dessa técnica é que ela fornece uma análise visual e quantitativa de vários fatores que podem influenciar a invasão do trophoblasto, incluindo a proliferação e a migração. Para iniciar o ensaio de arranhões, semear o número apropriado de células em uma placa de 24 poços para alcançar 100% de confluência em 48 horas.
No dia seguinte, mude a mídia para fenol red free media complementada com calor inativado carvão dextran despojado FBS. No dia do arranhão, adicione o tratamento desejado à mídia em cada poço para pré-trar as células por 30 minutos. Para criar feridas uniformes, coloque as pontas de pipeta de 10 microliter estéreis nos pinos da ferramenta fabricante de feridas.
Abaixe as pontas para a primeira linha de poços e mova a placa ao longo da pista do fabricante da ferida até que as pontas da pipeta cheguem ao outro lado do poço. Em seguida, mova a placa de volta para a posição inicial para garantir a ferida constante através do diâmetro do poço. Abaixe as pontas para a próxima linha de poços e repita até que todos os poços estejam riscados.
Confirme se o arranhão cobre a largura do poço observando a placa sob um microscópio. Em seguida, aspire cuidadosamente a mídia e lave suavemente as células com 1x PBS duas vezes. Após uma lavagem final, adicione fenol vermelho complementado livre de strip ou baixa mídia FBS com um tratamento desejado.
Em seguida, coloque a placa com os poços riscados em um imager timelapse automatizado alojado em uma incubadora que contém 37 graus Celsius de temperatura e 5% de dióxido de carbono a 95% da atmosfera de umidade. Imagem das células em intervalos regulares, conforme necessário, para permitir que as células completem a cicatrização da ferida. Para iniciar o ensaio de invasão, semeou o número apropriado de células em placas de seis poços em uma incubadora que mantém 37 graus Celsius de temperatura e 5% de dióxido de carbono a 95% da atmosfera de umidade.
Permitir que as células atinjam 90% de confluência em 48 horas. No dia seguinte, mude a mídia para fenol red free media complementada com calor inativado carvão dextran despojado FBS. Coloque um frasco de 10 miligramas por matriz extracelular mililitro em uma geladeira no gelo e deixe descongelar durante a noite.
No dia seguinte, use pontas de pipeta geladas para diluir 10 miligramas por mililitro da matriz extracelular com a mídia livre de soro vermelho fenol para uma concentração final de cinco miligramas por mililitro. Em seguida, adicione 100 mililitros da matriz extracelular diluída às pastilhas resfriadas que foram colocadas na placa de 24 poços refrigerados. Incubar a placa a 37 graus Celsius para permitir que a matriz endureça.
Para preparar células para o ensaio de invasão, lave as células com um mililitro de 1x PBS. Em seguida, aspire o PBS e adicione 500 microliters de 1x Trypsin EDTA a cada poço. Coloque a placa de seis poços na incubadora que mantém 37 graus Celsius de temperatura e 5% de dióxido de carbono a 95% da atmosfera de umidade até que todas as células tenham se separado da parte inferior da placa.
Uma vez que as células tenham se destacado, adicione 500 microliters da mídia livre de soro vermelho fenol a cada poço das células experimentadas. Em seguida, transfira 1.000 microliters de células separadas para um tubo de microcentrífuga e gire por cinco minutos a 400 vezes g a quatro graus Celsius. Em seguida, aspire a mídia e resuspend as células na mídia livre de soro vermelho fenol.
Conte as células usando um contador celular automatizado e ajuste o volume da suspensão celular para uma concentração final de 0,5 milhões de células por mililitro. Adicione 600 microliters da mídia de crescimento completo a cada poço da placa de 24 poços e coloque a inserção pré-revestida nele. Em seguida, adicione 200 microliters de células em cima de cada inserção celular pré-revestida para um total de 0,1 milhões de células.
Coloque a placa de 24 poços na incubadora que mantém temperatura de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono a 95% da atmosfera de umidade por 24 horas. Após a incubação durante a noite, sucção a mídia restante das câmaras superior e inferior sem perturbar a matriz extracelular. Em seguida, remova cuidadosamente a matriz extracelular e as células não invadidas da porção superior das pastilhas com um cotonete.
Lave cada inserção três vezes adicionando 1x PBS às câmaras superior e inferior do poço. Aspirar PBS após cada lavagem. Para fixar as células presas às pastilhas, coloque as pastilhas em metanol frio 100% gelado a quatro graus Celsius por 30 minutos.
A lavagem insere três vezes com 1x PBS e remova o PBS após a lavagem final. Colorir as células presas às pastilhas com violeta 0,2% cristalina em 20% de etanol por 10 minutos. Enxágüe com água deionizada três vezes e aspirar água deionizada após a lavagem final.
O ar seco se insere à temperatura ambiente por uma hora. Finalmente usando fórceps e uma lâmina de barbear, corte cuidadosamente a membrana inferior da inserção e monte-a em uma lâmina de vidro com o lado inferior voltado para cima. Usando um microscópio leve com um objetivo de 20X, obtenha pelo menos quatro imagens únicas das células invadidas por amostra.
Para iniciar o ensaio de proliferação, use um contador automatizado de células para contar as células experimentadas do frasco. Células de sementes em placas de seis poços a uma densidade de 0,2 milhões de células por poço em mídia de crescimento padrão. Em seguida, coloque as células na incubadora que mantém 37 graus Celsius de temperatura e 5% de dióxido de carbono em atmosfera de 95% de umidade por quatro horas ou até que as células tenham aderido.
Em seguida, mude a mídia para fenol red free free complementada com o dextran de carvão inativado de calor e tratamento desejado. Coloque a placa de seis poços na incubadora que mantém temperatura de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono a 95% da atmosfera de umidade. Em seguida, substitua a mídia pela mídia fresca complementada com o tratamento desejado a cada 48 horas.
Após 24, 48 ou 72 horas de tratamento, lave as células com um mililitro de 1x PBS e adicione 500 microliters de Trypsin EDTA a cada poço. Coloque uma placa de seis poços na incubadora até que as células se despem da placa. Uma vez que as células tenham se separado da placa, adicione 500 microliters da mídia livre de fenol complementado para desativar a Trippsina.
Finalmente adicione cinco microliters das células experimentadas a cinco microliters de Trypan Blue em um tubo separado e misture por pipetação. Use um contador automatizado de células para contar células de cada poço em duplicata. Imortalizado humano no primeiro trimestre trophoblast Cisne.
Foram tratadas 71 células durante zero, oito e 18 horas com veículo 1x PBS ou 100 micromolar da dexametasona glicocorticoide sintética no ensaio de arranhões. Medição do tamanho da ferida e da densidade da ferida em Cisne. 71 e células HTR-8/SVneo tratadas com veículo ou 100 dex nanomolar mostraram que o tratamento dex reduziu a taxa de fechamento da ferida indicando que glicocorticoides poderiam inibir a migração celular.
Após o ensaio de invasão, o tratamento glicocorticoide reduziu a invasividade celular, como mostra uma redução de 15% no número de cisnes invadidos. 71 e células HTR-8/SVneo tratadas com 100 dex nanomolar por 24 horas em comparação com células tratadas com veículo. Após o ensaio de proliferação celular, o tratamento glicocorticoide reduziu a proliferação celular, como indicado por menos Cisne.
71 e células HTR-8/SVneo tratadas com 100 dex nanomolar em comparação com células tratadas com veículo. Métodos para avaliar a morte celular poderiam ser usados em conjunto com este procedimento para determinar se apoptose ou necrose contribuem para funções de trophoblasto alteradas. Adotamos exclusivamente o uso de técnicas padrão rotineiramente utilizadas na biologia do câncer para o estudo da função trophoblast.
Não há riscos associados a esses métodos. A única precaução que os espectadores devem tomar é usar técnica estéril para cultura tecidual.
