L’étude du microenvironnement tumoral est difficile en raison de sa complexité. Nous avons développé des microrésorés de microenvironnement composés de microenvironnements combinatoires simples qui permettent l’identification des principaux moteurs des phénotypes tumoraux. L’avantage majeur de la plate-forme MEMA est que parce que les conditions de microenvironnement sont toutes définies, il est simple d’identifier les facteurs de microenvironnement qui stimulent les phénotypes d’intérêt.
La plate-forme MEMA est largement applicable dans d’autres systèmes non cancéraux, y compris les souches de cellules primaires et les cellules souches. Il y a un certain nombre de trucs et d’étapes d’ingénierie que nous avons développés pour accélérer le travail de banc humide et simplifier le protocole. Pour commencer, utilisez une imprimante à broches tactiles pour imprimer le mélange d’impression matricielle extracellulaire en taches fiduciales dans des plaques de huit puits.
Utilisez des broches de diamètre de 350 micromètres disposées dans une configuration de tête d’impression quatre fois sept pour imprimer la matrice extracellulaire pour les microrésonnements. Le bloc de collagène est imprimé sur memas comme une grille. Les puits remplis de PBS fournissent une humidité supplémentaire pour éviter le dessèchement de la plaque source du mélange d’impression matricielle extracellulaire.
Imprimez les tableaux dans les plaques de huit puits comme 20 colonnes par 35 lignes, pour un total de 700 taches. Après impression, conserver les assiettes dans un dessiccateur pendant au moins trois jours avant de les utiliser. Tout d’abord, concevoir une disposition de plaque de 96 puits avec espacement qui permet l’utilisation d’une pipette multicanal avec quatre pointes espacées, de sorte que le traitement de nombreuses plaques MEMA peut être fait à la fois.
Puis récupérer les ligands du congélateur, et décongeler dans la glace dans un capot d’écoulement laminaire. Feuilletez brièvement et tournez vers le bas chaque tube. Utilisez le tampon recommandé par le fabricant pour diluer les ligands à un stock de travail 200 fois.
Pipette 10 microlitres de chaque stock de ligand 200 fois dans le puits correspondant dans la plaque de 96 puits. Utilisez un film d’étanchéité pour sceller les plaques et les conserver à moins-20 degrés Celsius. Faites des plaques de traitement ligand en lots, et capturez toutes les métadonnées pour l’analyse en aval.
Avant de faire la culture des cellules, bloquer les MEMA avec deux millilitres par puits de tampon de blocage nonfouling pendant 20 minutes. Utilisez un séparateur Y avec deux pipettes Pasteur pour aspirer tampon de blocage dans plusieurs puits à la fois, puis triple laver les puits avec PBS. Pour éviter la dessiccation, laissez le volume final de PBS dans les puits jusqu’à ce qu’il soit prêt pour le placage cellulaire.
Avant une expérience MEMA complète, optimisez la concentration d’ensemencement des cellules MCF7 en effectuant une expérience de titration cellulaire. Un endroit idéal, comme indiqué ici, a un nombre suffisant de cellules pour extraire des données, mais pas tellement que l’endroit est trop confluent. Dans le MEMA, aspirer les cellules MCF7 restantes de PBS et de graines à 30 000 à 35 000 cellules par puits dans deux millilitres de milieu d’ensemencement.
Placez le MEMA dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Après l’adhérence pendant la nuit dans l’incubateur, aspirer le milieu et remplacer par deux millilitres de milieu de croissance réduit pour isoler l’impact stimulant de ligands spécifiques. Décongeler ensuite une plaque de traitement ligand préalablement congelée sur la glace.
Centrifugeuse plaque décongelée à 200 fois g pendant une minute. Transférer 200 microlitres de milieu de chaque puits dans la plaque de culture MEMA au puits approprié dans la plaque de traitement ligand. Pipette de haut en bas pour mélanger le ligand avec le milieu, et transférer ce mélange vers le puits approprié dans la plaque de culture MEMA.
Rock légèrement à la main et retourner les plaques MEMA à l’incubateur pour la culture de la combinaison ligand-ECM à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après 71 heures, ajouter 100 fois EdU aux puits MEMA pour une concentration finale de 10 micromolaires. Incubez-le pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Après l’incubation finale, aspirer les puits. Fixer les MEMA en deux millilitres par puits de 2%PFA pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, aspirez le PFA des puits.
Perméabilize avec deux millilitres par puits de 0,1% surfactant non ionique pendant 15 minutes. Aspirer le surfactant, puis laver les puits avec deux millilitres de PBS et PBS-T, séquentiellement. Par la suite, ajoutez 1,5 millilitres de réaccentrages de réaction de détection EdU à chaque puits.
Incuber pendant une heure à température ambiante, à bascule et à l’abri de la lumière. Ensuite, étancher la réaction avec 1,5 millilitre tampon d’étanchéation commerciale par puits. Aspirez à nouveau et lavez-les avec du PBS-T avant d’incuber avec des concentrations optimisées de taches ou d’anticorps.
Incuber les puits MEMA avec des anticorps primaires dans le tampon de coloration, se berçant à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après l’incubation primaire d’anticorps, lavez les puits avec PBS suivis de PBS-T. Ajouter des anticorps secondaires dans 0,5 microgramme par millilitre DAPI, dilué dans le tampon de coloration.
Incuber, en basculant pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Lavez les puits deux fois avec deux millilitres par puits de PBS, et laissez-les dans les deux derniers millilitres de PBS. Pour colorer le MEMA taché, placez-le au microscope d’un système d’imagerie automatisé avec des canaux de détection fluorescents appropriés.
Sortie des données d’image résultantes vers un système de gestion d’image. Segmentez les cellules et calculez les niveaux d’intensité à l’aide de CellProfiler. Dans ce protocole, les profils de cycle cellulaire des valeurs d’intensité binned DAPI par rapport au nombre de cellules d’une plaque de huit puits indiquent les cellules dans la phase de cycle cellulaire G1 contre G2.
Cela correspond à deux teneurs en NDNA dans les cellules en phase de croissance précoce, et quatre teneurs en NDNA dans les cellules sur le point de subir une mitose. L’impact du microenvironnement des ligands et de l’ECM sur le nombre de cellules et l’incorporation d’EdU est démontré. Le rouge indique un nombre de cellules plus élevé, et le bleu est un nombre de cellules inférieur.
Beaucoup d’effets sont ligand-conduits, car la condition d’ECM n’a pas fortement impacté le nombre de cellules ou la positivité d’EdU. Natagen 1 est une exception claire, car la présence de cette molécule ECM inhibe la liaison cellulaire et la croissance du MCF7. Ligands tels que FGF6 et neuregulin-1 alpha améliorer le nombre de cellules et ont des taux élevés d’incorporation EdU, tandis que les ligands tels que l’amphiregulin et neuregulin-1 SMDF inhibent la liaison cellulaire et la croissance des cellules.
Un exemple de cellules MCF7 se développent sur un spot MEMA traité avec neuregulin-1 alpha montre des taux élevés d’incorporation d’EdU, indiqués par les noyaux roses. Dans cette image, la tache verte est masque cellulaire, et le bleu est DAPI. Étant donné qu’une expérience MEMA complète coûte cher, il est très important d’effectuer des étapes d’optimisation, telles que des titrations cellulaires et sériques, avant d’effectuer l’expérience complète.
Une fois que les conditions microenvironnementales d’intérêt sont identifiées à l’aide de la plate-forme MEMA, les ligands spécifiques et les protéines matricielles extracellulaires peuvent être étudiés plus en profondeur à l’aide des systèmes traditionnels de culture cellulaire 2D et 3D.
