Ce protocole pour la production de vecteurs viraux AAV est rentable et donne une AAV de haute pureté, à titre élevé et de qualité recherche pour une utilisation dans des modèles précliniques de grands animaux. Cette technique utilise des cellules HEK293 adhérentes dans des chambres de culture cellulaire, ce qui est efficace en termes de temps et moins pratique, ce qui permet moins de perturbations des cellules. Ce protocole peut grandement aider à la production de vecteurs viraux pour le domaine de la thérapie génique, et peut également être utilisé pour la production d’autres sérotypes AAV qui se lient également au sulfate d’héparane.
Pour commencer, collectez les cellules HEK293 de la culture lorsqu’elle atteint 80% de confluence. Aspirer le milieu avant de laver doucement la plaque de culture cellulaire avec trois millilitres de PBS. Ensuite, aspirez le PBS et ajoutez trois millilitres de trypsine.
Incuber les plaques pendant deux minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, neutraliser la trypsine, en ajoutant sept millilitres de DMEM complet à la plaque, et recueillir le surnageant dans des tubes coniques de 50 millilitres. Inversez doucement les tubes pour vous assurer que les cellules sont homogènes.
Pour déterminer la densité cellulaire, mélanger 10 microlitres d’échantillons cellulaires avec 10 microlitres de bleu de trypan. Et ajoutez le mélange à une lame de comptage de cellules à analyser dans le compteur de cellules. Mélangez la suspension cellulaire avec un litre de DMEM complet préchauffé pour voir la chambre de culture.
Faites pivoter doucement la chambre pour répartir les cellules uniformément. Incuber la chambre à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. En plus de la chambre de culture cellulaire, les cellules de culture à 10 à la quatrième cellule par centimètre carré dans une plaque de 15 centimètres comme référence pour la confluence.
Après 65 heures d’incubation, lorsque les cellules sont confluentes à 80 à 90%, ajoutez lentement le mélange polyéthylèneimine-ADN et DMEM dans le port de la chambre de culture cellulaire. Répartissez le liquide uniformément sur toutes les rangées avant d’incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Après l’incubation, secouez vigoureusement la chambre de culture cellulaire pour déloger les cellules jusqu’à ce que le milieu semble trouble et versez-la dans des tubes centrifuges de quatre ou 500 millilitres.
Abattez les cellules par centrifugation à 18 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Versez le surnageant clarifié dans une bouteille petG d’un litre et remettez en suspension les pastilles de cellule dans 50 millilitres de tampon autorisé dans des tubes de centrifugeuse de 500 millilitres. Incuber les tubes pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius.
Après incubation, centrifugez les tubes à 18 000 fois G pendant 30 minutes et transférez le surnageant dans la même bouteille petG d’un litre. Conserver à moins 80 degrés Celsius. Décongeler le lysat brut à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Une fois décongelé, filtrez-le à l’aide d’un filtre de 0,22 micron. Immédiatement avant les étapes de purification, passivatez le concentrateur centrifuge en ajoutant quatre millilitres de tampon de prétraitement du filtre pour chaque colonne d’héparine-sépharose utilisée. Placez le tube dans une pompe péristaltique.
Exécutez séquentiellement les solutions et les médias. Préparez-vous à la chromatographie en attachant une colonne d’héparine-sépharose de cinq millilitres au tube et en faisant passer 25 millilitres de DMEM Bazell à travers la colonne. Ensuite, chargez 0,2 micromolaire du lysat brut filtré sur la colonne à un débit d’une à deux gouttes par seconde.
Lavez la colonne séquentiellement pour éluer cinq millilitres cinq fois avec 300 millimolaires de chlorure de sodium HBSS, avec du magnésium et du calcium, et étiquetez les cinq élutions comme E1 à E5. Lorsque vous êtes prêt, faites tourner le concentrateur centrifuge contenant le tampon de prétraitement à 900 fois G pendant deux minutes. Jetez le flux. Lavez le filtre du concentrateur centrifuge avec quatre millilitres de HBSS avec du magnésium et du calcium en tournant à 1000 fois G pendant deux minutes.
Ajoutez ensuite l’élution E2 au concentrateur centrifuge et faites tourner à 1000 fois G pendant cinq minutes. Jetez le flux. De même, faites tourner l’élution E3 dans le concentrateur centrifuge jusqu’à ce que le virus concentré soit d’environ un millilitre.
Retirez le virus concentré du concentrateur centrifuge à l’aide d’une pointe filtrée P200 et collectez-le dans un tube centrifuge stérile de 1,5 millilitre. Après la collecte du virus, rincer le concentrateur centrifuge avec 200 microlitres de HBSS avec du magnésium et du calcium. Pipettez vigoureusement de haut en bas pendant 30 secondes pour déloger tout virus adhéré à la membrane et recueillir le virus concentré dans le même tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre.
Mélangez bien le tube. Lavez la colonne et saturez avec de l’éthanol à 20% avant de la conserver à quatre degrés Celsius. Conservez le tube de la pompe dans un hydroxyde de sodium molaire.
L’efficacité de transduction de la capside AAV6.2FF a été comparée chez des souris, des hamsters et des agneaux pendant 28 jours après administration intramusculaire. Des souris ont administré cinq fois 10 au 12e génome vecteur par kilogramme d’IgG humaine AAV6.2FF, exprimées entre 171 et 237 microgrammes par millilitre d’IgG humaine dans le sérum. Le hamster est administré à deux fois 10 à 13e génomes vectoriels par kilogramme d’IgG humaine AAV6.2FF, exprimées à des niveaux beaucoup plus élevés d’IgG humaine que les souris.
Alors que le grand modèle animal a été capable d’exprimer en moyenne 35 microgrammes par millilitre des niveaux d’IgG humaine dans le plasma. Les grands modèles animaux peuvent déterminer l’expression du transgène AAV in vivo et déterminer si les transgènes ont un effet thérapeutique contre le trouble ou la maladie d’intérêt. L’étude a mis en évidence la grande capacité de transduction de l’AAV6.2FF, un nouveau vecteur de sérotype AAV 6 dans le muscle squelettique, ainsi que la faible immunogénicité des vecteurs viraux AAV in vivo.
