Les techniques qui surveillent la charge bactérienne et un neutrophile réagissent simultanément peuvent fournir un aperçu des mécanismes de la persistance de Staph aureus et de l’efficacité des stratégies de traitement. Le principal avantage de cette technique est que plusieurs paramètres peuvent être mesurés longituditinement dans un hôte vivant tout au long de la durée de l’infection. Il est essentiel de montrer où placer la plaie sur un dorsum de souris, comment exciser la peau, et comment inoculer la plaie avec Staph aureus.
Commencez par décongeler la souche staph aureus de bioluminescence d’intérêt du stockage négatif de 80 degrés Celsius sur la glace. Avant de strier la culture sur une plaque d’agar de sang bovine de 5%. Pour une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius.
Le lendemain matin, transférez trois à quatre colonies individuelles de la plaque staph aureus dans le bouillon de système tryptique, ou BST. Complété avec 10 microgrammes par millilitre de chloramphéniphélique pour une incubation de secousses pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, diluer 120 microlitres d’échantillon de culture en six millilitres de BST.
Avec 10 microgrammes par millilitre de chloramphéniphéniol, pour une incubation de deux heures à 37 degrés Celsius, et 200 rotations par minute. Lorsque la densité optique à 600 nanomètres atteint 0,5, transférer trois millilitres de suspension bactérienne en DPBS glacé de 10 millilitres. Après avoir soigneusement décanté le supernatant, ajouter dpbs refroidi supplémentaire à la pastille, et vortex les bactéries re-suspendues à fond.
Après une deuxième centrifugation, suspendre à nouveau la pastille bactérienne dans 1,5 millilitres de PBS sur la glace. Pour vérifier la concentration des bactéries, diluer en série 100 microlitres de la suspension bactérienne par un facteur de 1 x 10 au 4e, et de 1 x 10 au 5e, en PBS frais. Et plaque 20 microlitres de chaque dilution sur des plaques d’agar individuelles.
Après une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius, comptez le nombre d’unités formant des colonies par examen brut pour calculer la concentration bactérienne par rapport à la veille. Pour les blessures excisionnelles de la peau des animaux receveurs, confirmer un manque de réponse à la pincement des pieds, avant de raser une section d’un par deux pouces sur le dos de la souris. Essuyer délicatement pour enlever les poils errants.
Et désinfectez la peau exposée, avec de l’iode séquentiel de 10% povidone, et 70% des applications de gaze imbibée d’éthanol. Se déplaçant vers l’extérieur à partir du centre de la zone chirurgicale, dans un modèle en spirale. Après avoir laissé sécher la peau pendant environ une minute, appuyez fermement sur une biopsie stérile de six millimètres au centre de la zone chirurgicale préparée.
Tordez la biopsie de poinçon pour créer un contour circulaire sur la peau, qui coupe entièrement à travers le tissu de peau, et au moins une section du contour. Prendre soin de ne pas couper dans le fascia sous-jacent ou les tissus. Ensuite, utilisez des ciseaux stériles, et des forceps, pour couper à travers l’épiderme et le derme, suivant le modèle circulaire imprimé par la biopsie punch.
Pour l’inoculation de Staphylocoque aureus, remplissez une seringue d’insuline de calibre 28 avec 50 microlitres de l’inoculant bactérien bioluminescent préparé. Et utilisez un doigt pour tirer le derme de l’animal blessé sur le côté. Tenant la seringue presque parallèle au tissu, insérez lentement la seringue dans le tissu jusqu’à ce qu’une diminution soudaine de la résistance se fait sentir.
Indiquant le perçage du fascia. Avec l’aiguille placée au centre de la plaie, livrer lentement tout le volume de l’inoculant. Confirmez que l’inoculant forme une bulle au centre de la plaie, avec un minimum de fuite ou de dispersion.
Et retirez la seringue lentement de l’animal. Ensuite, retournez l’animal dans sa cage avec de la chaleur et de la surveillance jusqu’à ce qu’il se rétablisse complètement. Après la blessure et l’infection, et tous les jours pendant l’expérience, placez la souris anesthésiée dans un imageur bioluminescent et florescence, avec la plaie aussi plate que possible.
Dans le logiciel imageur, sélectionnez la luminescence et photographiez comme modes d’imagerie. Le temps d’exposition doit être prédéfini à une minute au petit binning, F/Stop 1 pour la luminescence, F/Stop 8 pour la photographie, et ouvert pour le filtre d’émission. Cliquez ensuite sur acquérir, pour enregistrer l’image.
Pour l’imagerie par fluorescence in vivo, sélectionnez fluorescence et photographie, comme modes d’imagerie. Le temps d’exposition devrait être prédéfini à une seconde à la petite binning, F/Stop 1 pour la fluorescence, F/Stop 8 pour la photographie, et excitation et longueurs d’onde d’émission de 465 plus de 30 nanomètres, et 520 plus de 20 nanomètres, avec une intensité élevée de lampe, respectivement. Cliquez ensuite sur acquérir pour enregistrer l’image.
Après avoir obtenu les deux ensembles d’images, retournez l’animal dans sa cage, avec surveillance, jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli. Pour l’analyse d’image, ouvrez l’image à quantifier, dans un logiciel d’analyse d’image approprié, et placez la région circulaire par défaut d’intérêt sur toute la zone de la plaie, y compris la peau environnante. Cliquez sur mesurer la région d’intérêt et enregistrer les valeurs du flux moyen de la plaie, pour permettre de tracer le flux moyen de chaque signal par rapport au temps.
Pour mesurer la cicatrisation de la plaie, adapter une zone circulaire d’intérêt sur le bord de la plaie, et mesurer la zone de la plaie en centimètres carrés, pour permettre le tracé du changement fractionnel de la ligne de base par rapport au temps. Dans cette expérience représentative, la réponse primaire conditionnelle de différenciation myéloïde d’expression d’EGFP 88, ou souris de KO de MyD88, a démontré une plus grande susceptibilité à l’inoculation d’aureus de Staphylocoque, que l’EGFP non conditionnel exprimant des animaux. Avec une létalité de 80% observée pendant les huit premiers jours de l’infection.
Les deux souches de souris ont perdu environ 5% de leur poids corporel immédiatement après l’infection. Cependant, l’EGFP conditionnelle exprimant des souris a récupéré leurs poids originaux par jour deux. Alors que les souris MyD88 n’ont pas.
La fermeture de blessure en présence de l’infection d’aureus de Staphylocoque n’était pas différente entre les deux souches. Cependant, les souris myD88 ko mortellement blessées, ont eu un défaut significatif dans la guérison de blessure, comparée à l’EGFP conditionnel exprimant des animaux. L’imagerie animale entière a indiqué un fardeau bactérien plus élevé, comme en témoigne un signal bioluminescent accru dans les blessures des animaux de KO MyD88, comparé à l’EGFP conditionnel exprimant des animaux.
Une diminution de 40 % du trafic initial de neutrophiles sur les plaies non infectées des animaux à élimination directe MyD88 a également été observée par rapport à l’EGFP conditionnelle exprimant des animaux. Lorsque 1 x 10 à la 7e colonie formant des unités de Staph aureus ont été introduites immédiatement après la blessure, le trafic de neutrophiles a été considérablement atténué chez les animaux knock-out par rapport à l’EGFP conditionnelle exprimant des animaux. Avant de distribuer les bactéries, assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la seringue et que l’emplacement de l’aiguille est correctement positionné au centre de la plaie.
Les tissus animaux peuvent être récoltés à la fin pour mesurer l’expression des protéines d’intérêt et la dissémination bactérienne de la plaie. Le staphylocoque est contagieux pour l’homme. En tant que tel, l’équipement de protection individuelle doit être porté lors de la manipulation des bactéries, et la prudence doit être exercée, lors de la manipulation d’une seringue contenant l’agent pathogène.
Cette technique a aidé à explorer l’utilisation de traitements biologiques pour les infections à Staphylocoque aureus qui améliorent la réponse immunitaire innée hôtes contre l’infection.
