Les applications cliniques de la trachée tissulaire ont été limitées en raison de la sténose de greffe et de l’épithélialisation retardée. Un modèle muriaque de remplacement trachéal orthotopique permet l’étude des mécanismes cellulaires conduisant à la régénération. Les défauts à long segment des voies respiratoires peuvent dépasser ce que les thérapies actuelles sont capables de guérir.
La trachée d’ingénierie tissulaire offre le potentiel de créer un organe de remplacement pour ces conditions. Ce modèle peut être appliqué aux animaux ayant des propriétés transgéniques et de traçage de lignée. Nous pouvons ensuite moduler les facteurs hôtes contribuant à la régénération de la greffe.
L’un des principaux défis dans la production des échafaudages sera de mesurer et de déterminer que les paramètres d’électrospinning sont les mêmes à chaque fois. Ainsi, chaque fois que vous produisez un échafaudage, vous devez mesurer la distance de pointe-à-collecteur, l’humidité, et la température pour s’assurer que les échafaudages sont les mêmes à chaque fois. Le raffinement des techniques microchirurgicales et l’entretien du plan correct d’anesthésie pour permettre une ventilation spontanée tout au long de la procédure sont essentiels au succès de ce modèle.
Puisque la trachée hôte a un diamètre interne d’environ un millimètre, la manipulation et le placement de suture de greffe et de tissu indigène sont importants et mieux démontrés visuellement. Commencez par dissoudre huit pour cent de poids polyéthylène téréphtalate, ou PET, dans hexafluoroisopropanol et le chauffage de la solution résultante à 60 degrés Celsius. Pendant que la solution est réchauffée, dissoudre trois pour cent de poids polyuréthane, ou PU, dans hexafluoroisopropanol, combinant les solutions une fois que la solution PET a refroidi.
Chargez une seringue de 60 millilitres munie d’une aiguille à pointe émoussée de calibre 20 avec le mélange polymère. Utilisez la seringue et une alimentation à haute tension dc réglée à 14 kilovolts positifs sur l’aiguille, une autre alimentation à haute tension dc réglée à moins trois kilovolts, un débit de cinq millilitres par heure, et une distance de 20 centimètres de bout en substrat pour électrospiner le polymère sur une tige en acier inoxydable d’un millimètre de diamètre tournée à 350 rotations par minute. Poursuivre l’électrospinning jusqu’à ce qu’une épaisseur de mur d’échafaudage de 300 micromètres soit atteinte.
Ensuite, faites glisser l’échafaudage de la tige, placez l’échafaud sous vide pendant la nuit pour enlever tout solvant résiduel, et stérilisez l’échafaudage avec une dose de lumière ultraviolette de 350 millijoules par centimètre au carré pendant environ 15 minutes. Dans des conditions stériles, retirez la peau des membres postérieurs d’une souris C57-Black/6 de six à huit semaines avec des ciseaux fins et des forceps micro-Adson, et utilisez les forceps dumont numéro cinq et les forceps Dumont numéro 5/45 pour enlever le fascia et les tendons. Séparez les os pour permettre à chacun d’eux d’être coupé aux deux extrémités, et utilisez une seringue de cinq millilitres équipée d’une aiguille de calibre 25 pour rincer la moelle osseuse dans une boîte de Pétri contenant 30 millilitres de milieu RPMI.
Lorsque tous les os ont été rincés, filtrer la moelle osseuse à travers une passoire en nylon de 70 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres, et transférer le tube dans une armoire de biosécurité. Ajouter délicatement la solution de cellules mononucléaires filtrées sur le côté d’un tube de 15 millilitres contenant cinq millilitres de polysucrose et de diatrizoate de sodium sans mélanger les couches, et séparer le plasma des globules blancs et rouges par séparation du gradient de densité. À la fin de la centrifugation, recueillir la couche claire moyenne composée des cellules mononucléaires de moelle osseuse, et laver les cellules mononucléaires de moelle osseuse à un rapport un-à-un dans PBS par centrifugation.
Resuspendez la pastille en cinq millilitres de PBS pour un deuxième lavage, suivie d’une résuspension en 10 millilitres de milieu RPMI frais pour le comptage. Ensuite, recueillir les cellules avec une centrifugation supplémentaire, et diluer les cellules à une fois 10 à sept cellules par cinq microlitres de concentration fraîche RPMI. Avant d’ensemencer l’échafaudage, couper le polymère à une longueur de cinq millimètres au besoin et mouiller l’échafaudage avec cinq microlitres de milieu RPMI pendant cinq minutes.
À la fin de l’incubation, retirer l’excès de milieu et charger le lumen d’échafaudage avec cinq microlitres de la solution cellulaire mononucléaire de moelle osseuse pendant 10 minutes. Ensuite, insérez une aiguille de calibre 21 à travers le lumen de l’échafaudage, et placez la greffe dans un millilitre de RPMI moyen pendant la nuit dans un incubateur de 37 degrés Celsius. Après l’induction de l’anesthésie générale, confirmer un manque de réponse au pincement des pieds chez l’animal receveur, et appliquer de l’onguent sur les yeux de l’animal.
Couper les cheveux sur le site chirurgical du menton aux clavicules, et placer l’animal sur un coussin chirurgical dans une position dorsale couchée. En utilisant la technique aseptique, désinfecter le site chirurgical avec un povidone-iode séquentiel, 70% éthanol, povidone-iode essuyer série, et déplacer la souris sous un microscope disséquant avec la tête à 12 heures. Utilisez des ciseaux fins et des forceps micro-Adson pour faire une incision de midline des clavicules à l’os hyoïde, et utilisez dumont numéro cinq et numéro sept forceps fins et un coton-tige stérile pour nettoyer le fascia avant d’insérer un rétracteur colibri auto-retenant dans l’incision.
Utilisez les forceps pour ouvrir les muscles de la sangle pour exposer le cartilage thyroïdien, le cartilage cricoïde et la trachée, et séparez carrément la trachée des nerfs laryngés récurrents parallèles de chaque côté du tissu, suivis de la séparation circonférentielle de la trachée de l’œsophage. À l’aide d’une aiguille de calibre 20 et d’un marqueur chirurgical, tacher la partie antérieure de la trachée. Faites une incision sous le troisième anneau de cartilage trachéal à l’aide d’une paire de ciseaux à ressort Vannas-Tubingen et d’une paire de Forceps dumont numéro sept fins pour réséquer une section de trois œufs de trachée.
Tenir la trachée avec les forceps incurvés fins, utiliser une suture stérile en nylon 9-0 pour fixer l’extrémité distale de la trachée au sternum pour créer une trachéostomie temporaire, et utiliser l’aiguille de calibre 20 et marqueur chirurgical pour tacher la partie antérieure de la greffe. Pour implanter la greffe, utilisez une suture de nylon stérile 9-0, Dumont numéro sept forceps fins, et un porte-aiguille pour insérer les points proximaux-postérieur, proximal-latéral, et proximal-antérieur, et tourner l’animal 180 degrés. Lorsque la souris est en position, relâchez la trachéostomie temporaire et faites une incision latérale à cinq millimètres de la partie antérieure de la greffe pour faciliter l’anastomose distale.
Pour compléter l’anastomose distale, placez les sutures d’une manière similaire à l’anastomose proximale, et ré-approximativement la position de greffe et les muscles de courroie. Ensuite, fermez l’incision avec des sutures stériles de nylon 9-0 dans un modèle courant, et placez l’animal seul dans une cage de récupération placée sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à la récupération complète. Deux semaines après l’implantation, quelques cellules épithéliales basales peuvent être observées par kératine basale de cellules cinq et 14 colorant dans les sections de tissu-machinées de tissu trachéal de tissu de greffe.
Des cellules basales sont également détectées sur la surface luminale de la greffe à sept jours après l’implantation. Sur l’explantation et l’analyse histologique, la sténose de greffe a été identifiée comme facteur principal contribuant dans les souris greffées-implantées démontrant des signes de détresse respiratoire et de stridor. Notez que le télescopage de la greffe et de la trachée indigène est une conclusion commune en raison de la technique chirurgicale.
La coloration du F4/80 révèle les macrophages hôtes dans la région sténotique de la greffe en conjonction avec la présence des cellules épithéliales basales. Évitez la manipulation des nerfs laryngés récurrents et assurez-vous que les sutures proximales et distales sont en place pour permettre un joint hermétique à l’anastomose. Comme ce protocole traite des cellules mononucléaires de moelle osseuse dérivées de la biosécurité de niveau un souris agent, il est important de porter un équipement de protection individuelle approprié pour éviter la contamination.
