Actuellement, l’immunohistochimie est utilisée avec une fréquence croissante pour identifier la présence de marqueurs moléculaires spécifiques et leurs changements en cas de pathologies, donnant racine à la possibilité d’effectuer une analyse quantitative. L’immunohistochimie, principalement la technique d’immunofluorescence, est utilisée dans le modèle animal larvaire et adulte du poisson zèbre, mais on sait peu de choses sur un bon protocole d’immunohistochimie standard pour le poisson zèbre. Ici, nous décrivons et montrons un protocole qui peut être utilisé pour étudier la conservation évolutive des protéines importantes chez le poisson zèbre adulte.
Un bon protocole d’immunohistochimie chez le poisson zèbre adulte peut aider à sous-tendre l’utilité de ce modèle animal pour étudier l’expression morphologique et la distribution de biomolécules hautement conservées. Cette méthode peut également aider à analyser les altérations possibles de ces biomolécules dues à des conditions pathologiques corrélées à la physiopathologie humaine. Le Dr Lea Tunisi, doctorant de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Pour commencer cette procédure, transférez les blocs de tissus congelés préparés à un cryostat à moins 20 degrés Celsius. Couper le bloc en sections coronals ou sagittales de 10 micromètres. Ensuite, recueillir les tissus en sections de série alternatives sur des glissières en verre adhésif adapté à l’immunohistochimie, et les stocker à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à aller de l’avant.
Tout d’abord, utilisez un stylo résistant aux solvants pour délimiter la zone tissulaire sur la lame. Rincer les sections trois fois pendant cinq minutes chacune à l’aide d’un tampon de phosphate de 0,1 molaire. Ensuite, dissoudre 0,3 millilitres de Triton X-100 en 100 millilitres de tampon de phosphate 0,1 molaire pour préparer Triton X-100 0,3%Dissoudre 0,1% sérum normal d’âne dans le tampon de phosphate contenant 0,3%Triton X-100 pour préparer la solution de blocage.
Incuber les sections avec la solution du sérum normal d’âne dissous dans le tampon de permeabilization PB-Triton X-100 0.3%pendant 30 minutes à la température ambiante pour perméabiliser la membrane cellulaire et bloquer les emplacements non spécifiques de liaison. Tout d’abord, rincer les sections trois fois pendant cinq minutes chacune avec un tampon de phosphate de 0,1 molaire. Ajouter le mélange d’anticorps primaires dilués dans le PB-T, et incuber les sections pendant la nuit dans une boîte humide à température ambiante.
Le lendemain, rincer les sections trois fois pendant cinq minutes chacune avec un tampon de phosphate de 0,1 molaire. Incuber les sections à température ambiante pendant deux heures dans un mélange approprié d’anticorps secondaires dilués dans le PB-T. Pour commencer, rincer les sections trois fois pendant cinq minutes chacune avec un tampon de phosphate de 0,1 molaire.
Dissoudre 1,5 microlitres de DAPI en trois millilitres de tampon de phosphate pour préparer le dapi de teinture nucléaire. Contrestain les sections dans le colorant. Ensuite, utilisez le milieu de montage pour couvrez les glissières pour stabiliser les tissus et les taches pour une utilisation à long terme.
Les échantillons fluorescents peuvent être stockés dans l’obscurité à quatre degrés Celsius. Répétez le protocole d’immunofluorescence, et omettre l’anticorps primaire ou secondaire, ou remplacez l’antiséum primaire ou secondaire par un tampon de phosphate pour préparer le contrôle négatif. Ensuite, répétez le protocole d’immunofluorescence et pré-absorbez chaque anticorps primaire avec un excès de peptide relatif.
Répétez le protocole d’immunofluorescence sur des tranches de cerveau de souris pour préparer le contrôle positif. À l’aide d’un microscope confocal équipé d’une scène motorisée X-Y-Z, d’un appareil photo numérique et d’un logiciel d’acquisition et d’analyse, observez et analysez les sections immunotachées. Acquérir des images numériques avec les objectifs 5x, 20x et 40x.
Prenez des images de chaque section à faible grossissement dans chacun des canaux disponibles pour composer un montage à faible grossissement. Normalisez les images de fluorescence au maximum de contraste et de superposition. Dans toute la zone d’intérêt, recueillir série Z-piles d’images à travers six plans focaux avec des étapes focales de un à 1,8 micromètres.
Effectuez cette collection pour chaque canal séparément. Après cela, utilisez un logiciel de déconvolution d’imagerie pour déconvoler des images par application de 10 itérations, et l’effondrement des images en série Z-plane en une seule image de projection maximale. Utilisez un logiciel d’édition d’image approprié pour ajuster les micrographes pour la lumière et le contraste.
L’analyse immunohistochimique de la distribution ox-A et OX-2R dans l’intestin du poisson zèbre adulte montre différents sites de localisation de OX-A et OX-2R et leurs augmentations d’expression dans les cellules intestinales du poisson zèbre DIO. Une tache brune intense pour OX-A est observée dans les cellules de l’intestin médial et antérieur. L’immunoexpression d’OX-A donne des signaux clairs dans les différents compartiments intestinaux, diminuant de l’antérieur vers l’intestin médial.
Des résultats similaires sont observés pour l’immunoexpression OX-2R dans l’intestin du DIO et contrôlent le poisson zèbre de régime. Un signal OX-A accru chez le poisson zèbre adulte DIO s’accompagne de la surexpression d’OX-2R dans d’autres compartiments intestinaux. L’analyse précise des images immunofluorescentes montre l’augmentation de la colocalisation OX-2R/CB1R dans l’intestin du poisson zèbre adulte DIO par rapport au poisson zèbre de régime de contrôle.
Une situation semblable est observée dans différentes régions de cerveau, telles que le telencéphale dorsal, l’hypothalamus, le tectum optique, le lateralis de torus, et le noyau diffus du lobe inférieur. En doublant l’immunostaining avec la colocalisation d’orexin-A et de CB1R, on observe qu’il y avait une augmentation de la colocalisation dans les neurones orexinergiques de l’hypothalamus, accompagnée d’une augmentation du signal fluorescent orexin-A. Ces résultats montrent comment la double immunofluorescence peut aider à identifier l’expression physiologiquement conservée des protéines, la colocalisation des protéines cibles et leurs changements de distribution et/ou d’expression dans différentes conditions pathologiques.
En utilisant l’immunofluorescence, nous pouvons mieux comprendre la codistribution et la coexpression des biomolécules, leurs interactions possibles, et nous pouvons également avoir une image visible de leurs changements en cas de pathologies différentes. En outre, la distribution neuroanatomique de l’expression ou des récepteurs métaboliques d’enzyme peut encore révéler le rôle de la signalisation de protéine dans les tissus. Les travaux techniques actuels ont introduit l’approche d’immunofluorescence pour étudier deux systèmes fortement conservés, l’orexine et l’endocannabinoïdes, en utilisant un modèle adulte de poisson zèbre.
En utilisant ce protocole décrit ici pour la première fois dans le cerveau du poisson zèbre adulte, la distribution anatomique et la coexpression des récepteurs orexine-2 et des récepteurs endocannabinoïdes-CB1 n’a pas été déterminée. Nous recommandons les protocoles décrits ici pour des expériences d’immunohistochimie et pour détecter la distribution spatiale et l’organisation des récepteurs dans les peptides chez le poisson zèbre adulte pour mieux comprendre leurs fonctions.
