В настоящее время иммуногистохимия используется с возрастающей частотой для выявления наличия специфических молекулярных маркеров и их изменений в случае патологий, что дает корни возможности проведения количественного анализа. Иммуногистохимия, в основном иммунофлюоресценция техника, используется в личинки и взрослых зебры животных модели, но мало что известно о хорошем стандартном протоколе иммуногистохимии для зебры. Здесь мы описываем и иллюстрем протокол, который может быть использован для изучения эволюционного сохранения важных белков у взрослых зебр.
Хороший протокол для иммуногистохимии у взрослых зебры может помочь лежать в основе полезности этой модели животных для изучения морфологического выражения и распределения высокосхраняемых биомолекул. Этот метод также может помочь проанализировать возможные изменения этих биомолекул из-за патологических состояний, коррелирующих с физиопатологией человека. Демонстрация процедуры будет д-р Леа Tunisi, аспирант из моей лаборатории.
Чтобы начать эту процедуру, перенесите подготовленные замороженные блоки ткани в криостат при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Вырезать блок в корональных или sagittal разделов 10 микрометров. Затем соберите ткани в альтернативных серийных секциях на клеевые стеклянные слайды, пригодные для иммуногистохимии, и храните их при температуре минус 20 градусов по Цельсию до готовности к работе.
Во-первых, используйте растворительно-устойчивую ручку для демаркации области ткани на слайде. Промыть секции три раза в течение пяти минут каждый с помощью 0,1-молярного фосфатного буфера. Затем растворите 0,3 миллилитров triton X-100 в 100 миллилитров 0,1-молярного фосфатного буфера для подготовки Triton X-100 0.3%Растворить 0,1%нормальную сыворотку осла в фосфатном буфере, содержащем 0,3%Triton X-100 для подготовки блокирующего раствора.
Инкубировать секции раствором нормальной ослиной сыворотки, растворенной в пермеабилизации буфера PB-Triton X-100 0,3% в течение 30 минут при комнатной температуре для проницаемой клеточной мембраны и блокирования неспецифических связывающих участков. Во-первых, промыть разделы три раза в течение пяти минут каждый с 0,1-молярного фосфатного буфера. Добавьте смесь первичных антител, разбавленных в ПБ-Т, и инкубировать секции на ночь во влажной коробке при комнатной температуре.
На следующий день, промыть разделы три раза в течение пяти минут каждый с 0,1-молярного фосфатного буфера. Инкубировать секции при комнатной температуре в течение двух часов в соответствующей смеси вторичных антител, разбавленных в ПБ-Т. Для начала, промыть разделы три раза в течение пяти минут каждый с 0,1-молярного фосфатного буфера.
Растворите 1,5 микролитров DAPI в трех миллилитров фосфатного буфера для подготовки ядерного красителя DAPI. Счетчик разделов в краситель. Затем используйте монтажную среду для покрытия слайдов, чтобы стабилизировать ткань и пятно для длительного использования.
Флуоресцентные образцы могут храниться в темноте при четырех градусах цельсия. Повторите протокол иммунофлуоресценции, и либо опустить первичное или вторичное антитело, или заменить первичный или вторичный антисерум с фосфатным буфером, чтобы подготовить отрицательный контроль. Затем повторите протокол иммунофторесценции и предварительно усвоите каждое первичное антитело с избытком относительного пептида.
Повторите протокол иммунофлуоресценции на ломтиках мозга мыши, чтобы подготовить положительный контроль. Используя конфокальный микроскоп, оснащенный моторизованной сценой X-Y-Я, цифровой камерой, а также программным обеспечением для приобретения и анализа, наблюдайте и анализируйте иммунолентные секции. Приобретайте цифровые изображения с целями 5x, 20x и 40x.
Возьмите изображения каждого раздела при низком увеличении в каждом из доступных каналов, чтобы составить монтаж с низким увеличением. Нормализация изображений флуоресценции до максимального контраста и наложения. По всей области интересов, собирать серийные стеки изображений через шесть фокусных плоскостей с координационными шагами от одного до 1,8 микрометров.
Выполните эту коллекцию для каждого канала отдельно. После этого используйте программное обеспечение для деконволюции изображений для деконволюции изображений с помощью 10 итераций и с коллапса серийных изображений плоскости в единое максимальное проекционные изображения. Используйте соответствующее программное обеспечение для редактирования изображений, чтобы настроить микрографы для света и контрастности.
Иммуногистохимический анализ распределения OX-A и OX-2R в кишечнике взрослой зебры показывает различные места локализации OX-A и OX-2R и их увеличение экспрессии в кишечных клетках DIO зебры. Интенсивное коричневое окрашивание для OX-A наблюдается в клетках медиальной и передней кишки. Иммуноэкспрессия OX-A дает четкие сигналы в различных отсеках кишечника, уменьшаясь от передней к медиальной кишки.
Аналогичные результаты наблюдаются при иммуноэкспрессии OX-2R в кишечнике ДИО и контроля диеты зебры. Повышенный сигнал OX-A в DIO взрослых зебрафиш сопровождается переэкспрессией OX-2R в других кишечных отсеках. Точный анализ иммунофторесцентных изображений показывает увеличение ококализации OX-2R/CB1R в кишечнике взрослой зебры DIO по сравнению с контрольной диетой зебры.
Аналогичная ситуация наблюдается в различных областях мозга, таких как спинной теленцефалон, гипоталамус, оптическая тектум, тор позже, и диффузное ядро нижней доли. При двойном иммуностимунизации с помощью ораксина-А и колокализации CB1R наблюдается увеличение колокализации в орегсинергических нейронах гипоталамуса, сопровождаемое увеличением флуоресцентного сигнала ореноксина-А. Эти результаты показывают, как двойная иммунофлуоресценция может помочь определить физиологически сохраненное выражение белка, колокализацию целевых белков, а также изменения их распределения и/или экспрессии в различных патологических состояниях.
Используя иммунофлюоресценцию, мы можем лучше понять совместное использование и коэкспрессию биомолекул, их возможные взаимодействия, а также иметь видимое изображение их изменений в случае различных патологий. Кроме того, нейроанатомическое распределение экспрессии метаболических ферментов или рецепторов может еще больше выявить роль белка сигнализации в тканях. Нынешняя техническая работа представила иммунофлуоресценции подход к изучению двух высокосхраняемой системы, orexin и эндоканнабиноидов, в использовании взрослых зебры модели.
Используя этот протокол, описанный здесь в первый раз в мозге взрослых зебры, анатомическое распределение и коэкспрессия рецепторов orexin-2 и эндоканнабиноид-CB1 рецепторов не было определено. Мы рекомендуем описанные здесь протоколы для экспериментов с иммуногистохимией и для обнаружения пространственного распределения и организации рецепторов в пептидах у взрослых зебр, чтобы лучше понять их функции.
