현재, 면역조직화학은 특정 분자 마커의 존재와 병리학의 경우의 변화를 식별하기 위해 빈도를 증가시키는 데 사용되어 정량적 분석을 수행할 수 있는 가능성을 제공합니다. 면역화학, 주로 면역형화 기법은 애벌레와 성인 제브라피쉬 동물 모델에서 사용되지만, 제브라피시를 위한 좋은 표준 면역작용 프로토콜에 대해서는 거의 알려져 있다. 여기서, 우리는 성인 얼룩말물고기에 있는 중요한 단백질의 진화적인 보존을 연구하기 위하여 이용될 수 있는 프로토콜을 설명하고 기술합니다.
성인 얼룩말 피시의 면역 조직 화학에 대한 좋은 프로토콜은 매우 보존 된 생체 분자의 형태적 표현과 분포를 연구하기 위해이 동물 모델의 유용성을 강조하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 또한 인간 생리병리학과 상관되는 병리학 적 조건으로 인해 이러한 생체 분자의 가능한 변화를 분석하는 데 도움이 될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 과정 학생 인 Lea Tunisi 박사가 될 것입니다.
이 절차를 시작하려면 준비된 냉동 조직 블록을 영하 20도의 냉동 조직 블록으로 전송합니다. 10 마이크로미터의 관상 또는 처진 섹션에서 블록을 잘라냅니다. 그런 다음, 면역 작용화학에 적합한 접착제 유리 슬라이드에 대체 직렬 섹션에서 조직을 수집하고 진행 준비가 될 때까지 영하 20도에서 저장합니다.
먼저 용매 방지 펜을 사용하여 슬라이드의 조직 영역을 해명합니다. 0.1-대구형 인산염 버퍼를 사용하여 5분 동안 각각 섹션을 세 번 헹구는 다. 다음으로, 트리톤 X-100000000000000000000000000000에 0.3밀리리터를 용해하여 트리톤 X-100 0.3%를 준비하여 0.3%트리톤 X-100을 함유한 인산염 완충액에 0.1%의 일반 당나귀 혈청을 용용하여 차단용액을 준비한다.
투과화 버퍼 PB-Triton X-100 0.3%에서 용해된 일반 당나귀 혈청의 용액으로 섹션을 배양하여 실온에서 30분 동안 세포막을 침투시키고 비특이적 결합 부위를 차단한다. 먼저, 0.1-대구형 완충제로 5분간 각각 3회 헹구는 다. PB-T에서 희석된 1차 항체의 혼합을 추가하고 실온에서 습한 상자에 밤새 섹션을 배양합니다.
다음 날, 0.1-대구물산염 버퍼로 5분 동안 섹션을 세 번 헹구는 다. PB-T에서 희석된 이차 항체의 적절한 혼합에서 실온에서 2시간 동안 섹션을 배양한다. 시작하려면 0.1-대구형 인산염 버퍼로 5분 동안 섹션을 세 번 헹구는 다.
핵 염료 DAPI를 준비하기 위해 인산염 버퍼의 3 밀리리터에 DAPI의 1.5 마이크로리터를 용해. 염료의 섹션을 카운터스테인합니다. 그런 다음, 장착 매체를 사용하여 슬라이드를 덮어 장기간 사용하기 위해 조직과 얼룩을 안정화시하십시오.
형광 시료는 섭씨 4도에서 어둠 속에서 보관할 수 있습니다. 면역형성 프로토콜을 반복하고, 1차 또는 이차 항체를 생략하거나, 인산염 완충제로 1차 또는 이차 항혈을 대체하여 음의 대조를 준비한다. 다음으로, 면역형광 프로토콜을 반복하고, 상대펩티드를 초과하여 각 1차 항체를 미리 흡수한다.
양적 제어를 준비하기 위해 마우스 뇌 의 조각에 면역 형광 프로토콜을 반복합니다. X-Y-Z 전동 단계, 디지털 카메라 및 획득 및 분석 소프트웨어가 장착된 공초점 현미경을 사용하여 면역 스테인드 섹션을 관찰하고 분석합니다. 5배, 20배, 40배의 목표로 디지털 이미지를 획득합니다.
사용 가능한 각 채널의 낮은 배율에서 각 섹션의 이미지를 가져 와 낮은 배율 몽타주를 구성합니다. 형광 이미지를 최대 대비 및 오버레이로 정규화합니다. 관심 영역 전반에 걸쳐 1~1.8 마이크로미터의 초점 단계를 갖춘 6개의 초점 평면을 통해 일련의 Z 스택의 이미지를 수집합니다.
각 채널에 대해 이 컬렉션을 개별적으로 수행합니다. 그런 다음 이미징 데온볼루션 소프트웨어를 사용하여 10회 반복을 적용하여 이미지를 데큐볼레이션하고 직렬 Z-평면 이미지를 단일 최대 프로젝션 이미지로 축소합니다. 적절한 이미지 편집 소프트웨어를 사용하여 빛과 대비를 위해 현미경 그래프를 조정합니다.
성인 제브라피시의 장에서 OX-A 및 OX-2R 분포의 면역 조직화학 적 분석은 OX-A 및 OX-2R의 다른 국소화 사이트와 DIO 제브라피시의 장 세포에서의 발현 증가를 보여줍니다. OX-A에 대한 강렬한 갈색 염색은 내측 및 전방 장의 세포에서 관찰된다. OX-A의 면역발현은 전방에서 내장으로 감소하는 다양한 장구획에서 명확한 신호를 제공합니다.
DIO 및 대조식이 제브라피쉬의 장에서 OX-2R 면역발현에 대해 유사한 결과가 관찰된다. DIO 성인 제브라피시의 증가된 OX-A 신호에는 다른 장 구획에서 OX-2R의 과발현이 동반됩니다. 면역형 이미지의 정확한 분석은 제어 다이어트 제브라피시에 비해 DIO 성인 제브라피시의 장에서 OX-2R/CB1R 공동국화의 증가를 나타낸다.
등지 텔렌스팔론, 시상하부, 광학 텍텀, 투러스 측삭증 및 열등한 엽의 확산 핵과 같은 다른 뇌 영역에서도 유사한 상황이 관찰된다. 오렉신-A 및 CB1R 의 공동 국산화를 통해 이중 면역염색에 의해, 오렉신-A 형광 신호의 증가와 함께 시상하부의 오렉시너기크 뉴런에서 코현지화의 증가가 있었다는 것을 관찰된다. 이러한 결과는 이중 면역 형광이 생리적으로 보존 된 단백질 발현, 표적 단백질의 공동 지역화 및 다른 병리학 적 조건에서의 분포 및 / 또는 발현 변화를 식별하는 데 어떻게 도움이 될 수 있는지 보여줍니다.
면역 형광을 사용하여 생체 분자의 공동 분포 및 공동 발현, 가능한 상호 작용을 더 잘 이해할 수 있으며, 다른 병리학의 경우 변화에 대한 가시적 이미지를 가질 수 있습니다. 더욱이, 대사 효소 발현 또는 수용체의 신경 해부학 적 분포는 조직 내단백질 신호의 역할을 더욱 드러낼 수 있다. 현재기술적인 연구는 성인 얼룩말피 모델을 사용하여 두 개의 고도로 보존된 시스템인 오레신 및 엔도칸나비노이드를 연구하기 위한 면역형광 접근법을 도입했다.
여기에 설명된 이 프로토콜을 사용하여 성인 얼룩말피의 뇌에서 처음으로, 오렉스신-2 수용체및 엔도칸나비노이드-CB1 수용체의 해부학적 분포 및 공동발현이 결정되지 않았다. 우리는 면역 조직 화학 실험을 위해 여기에 설명된 프로토콜을 추천하고 그들의 기능을 더 잘 이해하기 위하여 성인 제브라피시에 있는 펩티드에 있는 수용체의 공간 분포 그리고 조직을 검출하는 것이 좋습니다.
